Очистка саркоэндоплазматического ретикулума Ca⁺-АТФазы из мышц кролика

Наши исследования сосредоточены на очистке SERCA с высоким структурным качеством и каталитической активностью, а также на изучении того, стабилизирует ли трегалоза SERCA во время очистки, повышая ее стабильность и функциональность. Определение трехмерной структуры АТФаз Р-типа в их олигомерных состояниях. Использование искусственного интеллекта для структурного моделирования АТФаз, моделирования структурной динамики и молекулярного докинга лигандов для изучения методов лечения заболеваний и улучшения анализа функции белка и новых технологий. Текущие задачи включают в себя понимание механизмов преобразования энергии в P-АТФазах, выяснение того, как четвертичная структура регулирует функцию и активность, а также определение эффективных ингибиторов для терапевтического применения при заболеваниях человека. Подтверждено гексамерное состояние протон-АТФазы плазматической мембраны GS и показана ее зависимость от структурной динамики или вязкости среды, как это описывается теорией Крамерса.

[Рассказчик] Для начала приобретите быстро сокращающиеся мышцы от дикого типа Oryctolagus cuniculus. Суспензируйте его в трех объемах по 100 миллимоляров хлорида калия для мацерации. Взбивайте в течение одной минуты, а затем дайте одну минуту ледяного отдыха. Центрифугируйте образец при 1500 г при 4 градусах Цельсия в течение 5 минут, чтобы удалить остатки ткани. Соберите надосадочную жидкость в пробирку, затем гомогенизируйте ее с помощью измельчителя тканей. Далее центрифугируют гомогенат, а затем надосадочную жидкость. Суспензируйте гранулы примерно в 40 миллилитрах 0,5 моляра сахарозы. Теперь центрифугируйте суспензию при 12 000 g при 4 градусах Цельсия в течение 15 минут. Перед центрифугированием разведите полученную надосадочную жидкость в 0,6 моляра хлорида калия и 0,15 молярной сахарозы. Суспензируйте гранулу, содержащую листы везикулы саркоплазматического ретикулума, в буфере, содержащем 0,3 моляра сахарозы, 0,1 моляра хлорида калия и 5 миллимоляров трис-гидрохлорида при pH 7,0. Аликвотируют пузырьки саркоплазматического ретикулума в объемах 1 миллилитр. Инкубировать суспензию везикулы саркоплазматического ретикулума на льду в течение 10 минут при слабом перемешивании, затем центрифугировать. Суспендируйте гранулу в менее чем 3 миллилитрах 25 миллимолярного трис-гидрохлоридного буфера. После гомогенизации суспензии отрегулируйте ее до конечного объема 10 миллилитров с помощью трис-гидрохлоридного буфера. Определите концентрацию белка с помощью анализа Лоури. Добавьте азолектин в дозе 5 миллиграммов на миллилитр, а затем добавьте 0,85 Цвиттергента 3-14. Снова гомогенизируйте суспензию и центрифугируйте при 100 000 г при 4 градусах Цельсия в течение 60 минут. Соберите надосадочную жидкость в новую пробирку. Разбавьте его в соотношении 1 к 2 с 2 миллимолярными EGTA при pH 7,2. Аккуратно вылейте суспензию на прерывистый градиент концентрации трегалозы в буфере Tris. Затем центрифугируете, как и раньше, и соберите прозрачные, слегка желтые гранулы. Осторожно суспензируйте гранулу в небольшом объеме буфера Tris. Измерьте концентрацию белка, затем разбавьте ее, чтобы отрегулировать концентрацию белка до 2 миллиграммов на миллилитр. Для активности АТФазы приготовьте 1 миллилитр реакционной смеси. Вихревой реакцию анализа гомогенизировать, затем инкубировать ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. Добавьте 0,9 единицы L-лактатдегидрогеназы и 1,5 единицы пируваткиназы. Добавьте 10 мкг SERCA, чтобы инициировать реакцию АТФазы. Отслеживайте изменение поглощения каждую секунду в течение 600 секунд на 340 нанометрах с помощью спектрофотометра с термостатическим держателем ячейки для определения образования NAD. Для анализа мечения SERCA флуоресцеином изотиоцианатом, или FITC, сначала суспендируют 20 мкг SERCA в 50 микролитрах мечеющего буфера. Вихрь хорошо перемешать. Затем инкубируйте образцы в темноте при комнатной температуре в течение 15, 10, 7, 5 и 2 минут. Чтобы остановить реакцию мечения, добавьте равный объем ледяного буфера. Выдерживать на льду в темноте в течение 5 минут. Подвергните SERCA с маркировкой FITC на SDS-PAGE. Подвергните прозрачные гели воздействию ультрафиолетового света на длине волны 302 нанометра и задокументируйте результат. Наконец, покрасьте гель синим Кумасси. Фотодокументируйте результат. Для анализа спектров кругового дихроизма сначала суспендируют SERCA в 400 микролитрах 10 миллимолярного фосфатного буфера pH 7,0 при температуре 25 градусов Цельсия. Загрузите образец в ячейку с длиной пути 0,1 сантиметра. Теперь установите диапазон дальних ультрафиолетовых спектров от 190 до 260 нанометров, а внутреннее разрешение и пропускную способность — 1 нанометр. Запишите сигнал кругового дихроизма со скоростью 50 нанометров в минуту при температуре 25 градусов Цельсия. Гель SDS-PAGE, окрашенный в синий цвет в Кумасси, продемонстрировал обогащение белковой полосы SERCA по мере продвижения очистки. Заключительная стадия очистки SERCA с использованием ультрацентрифугирования на градиенте концентрации трегалозы привела к чистоте, превышающей 90%. Везикулы саркоплазматического ретикулума содержали большое количество SERCA, при этом примерно 73% от общего белка в везикулах соответствовало этой P-АТФазе. Кинетическая картина Михаэлиса-Ментена наблюдалась для очищенной SERCA на кривой скорости гидролиза АТФ в зависимости от концентрации АТФ, что подтверждает его ферментативную функциональность. График Лайнуивера-Бёрка показал константу Михаэлиса, равную примерно 10 микромолям для АТФ, что согласуется с ранее опубликованными значениями. Мечение SERCA методом FITC указывает на наличие интактного сайта связывания нуклеотидов. Полоса SERCA с синим пятном Coomassie точно соответствовала полосе с маркировкой FITC. Спектроскопия кругового дихроизма подтвердила высокое структурное качество очищенного SERCA, при этом его спектр указывает на четко определенные вторичные элементы структуры.