Экстракция и очистка тканей Подготовка образцов головного и спинного мозга мышей
11 апреля 2025 г.
В этом исследовании представлен протокол извлечения и подготовки очищенных образцов всего головного и спинного мозга с сохраненными флуоресцентными сигналами, повышающий эффективность эксперимента и целостность данных для продвижения исследований в области нейробиологии.
Наше исследование сосредоточено на том, как центральная нервная система опосредует когнитивные функции и взаимодействует с иммунной системой. Мы стремимся усовершенствовать методы исследования головного и спинного мозга, решая фундаментальные вопросы об этих взаимодействиях. Эти методы сохраняют весь головной и спинной мозг неповрежденными, что помогает нам более тщательно картировать клетку с помощью очистки тканей. Кроме того, это делает процесс более быстрым и точным, сокращая время и количество ошибок по сравнению с традиционными методами секционирования и визуализации.
Мы составили карту областей головного и спинного мозга, соединенных с легкими. Наше исследование будет сосредоточено на изучении нейроиммунной связи между головным мозгом, спинным мозгом и легкими. И как это взаимодействие влияет на иммунные реакции.
[Инструктор] Для начала закрепите конечности мыши на широкой акриловой доске с помощью стальных зажимов. С помощью ножниц разрежьте кожу между двумя бедренными копытами и продолжайте резать вверх, пока не дойдете до диафрагмы. Раскройте обе стороны грудной клетки через диафрагму, используя ножницы и прямые щипцы для обнажения сердца. Введите инфузионную иглу диаметром 0,7 миллиметра, прикрепленную к перфузионной трубке, в левый желудочек и сделайте разрез на один-два миллиметра в придатке правого предсердия. После перфузии отделите кожу на спине и голове мыши с помощью офтальмологических ножниц. Разрежьте позвоночник в точке, где линия, соединяющая верхние задние края обеих конечностей, пересекается с позвоночным столбом. Удалите мышечную и жировую ткань с шеи и спины мыши, чтобы обнажить позвоночник и череп. Венозными ножницами разрежьте по средней линии промежуток между левой и правой сторонами позвоночника и спинного мозга от нижнего конца позвоночного канала. Затем удалите верхнюю часть и двусторонние стороны отрезанного позвоночника, чтобы обнажить спинной мозг. Повторяйте шаги до тех пор, пока не дойдете до соединения с мозгом. Поместите кончик одного лезвия венозных ножниц между большим затылочным отверстием и мозгом. Сдвиньте и разрежьте вдоль среднесагиттального шва, чтобы открыть череп. Используйте щипцы для удаления черепа и обнажения мозга. Теперь с помощью щипцов и венозных ножниц удалите ткань спинного мозга мыши с черепного конца. Используйте рассекающие щипцы для удаления оболочки спинного мозга под стереомикроскопом. Далее с помощью швов закрепите образец спинного мозга к фиксирующей пластине. Добавьте не менее чем в 20 раз больше объема образца 4% параформальдегида. После фиксации выбросьте параформальдегид и трижды промойте образец PBS. Для начала зафиксируйте извлеченный спинной мозг мыши в параформальдегиде. Для раствора для удаления липидов смешайте растворы А и В в соотношении по массе девять к одному. Добавьте 50 миллилитров раствора для удаления липидов в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров и поместите в нее неподвижную ткань. После инкубации в растворе С смените раствор и поместите чашку с культурой с образцом, полностью погруженным в раствор С, на световой короб с линией окалины. Для приготовления гелевого раствора в стеклянную бутылку объемом 200 миллилитров добавьте 147 грамм раствора С и три грамма агарозы. Хорошо перемешайте компоненты с помощью стержня для перемешивания, затем разогрейте в микроволновой печи, пока агароза не растворится. Переложите раствор геля в лабораторную печь, установленную на 37 градусов Цельсия. Налейте в форму слой темперированного геля глубиной два миллиметра 37 градусов Цельсия и охладите его в холодильнике при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут, пока он не станет полутвердым. Поместите соответствующий показатель преломления образец в форму, и добавьте раствор геля до уровня или немного ниже верхней части образца. Поместите форму обратно в холодильник с температурой четыре градуса Цельсия на два часа. Накройте крышкой и снова поставьте в холодильник. Снимите пинцетом крышку крышки и выньте внедренный образец. Добавьте 30 миллилитров раствора для визуализации в 50-миллилитровую трубку и погрузите образец в раствор. Нанесите клей 502, чтобы надежно прикрепить образец к держателю образца, прежде чем закрепить держатель на устройстве визуализации. Запустите программу сканирования и выберите уровень увеличения 4X в разделе увеличения. Нажмите кнопку калибровки, чтобы активировать режим калибровки. Нажмите кнопку предварительного просмотра, чтобы войти в режим предварительного просмотра. Затем нажмите кнопку движения в направлении Z, чтобы медленно перемещать образец вверх от нижней части камеры для образца, пока сгенерированный световой лист не пройдет через образец. Выберите подходящий лазерный канал и вариант режима подсветки. Выберите направление траектории сканирования для образца. Нажмите кнопку автоматического сканирования, чтобы начать съемку образца. Протокол успешно сохранил весь головной и спинной мозг мыши, сохранив при этом неповрежденные флуоресцентные сигналы для четкого изображения. Флуоресцентная визуализация образца головного и спинного мозга четко визуализировала детальные нейронные структуры. Изображения с большим увеличением обеспечили улучшенную визуализацию отдельных флуоресцентно меченых клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен протокол экстракции и подготовки просветленных образцов всего мозга и спинного мозга с сохранением флуоресцентных сигналов. Данный подход повышает эффективность экспериментов и обеспечивает целостность данных для развития нейробиологических исследований. Разработанные методы представляют собой более быструю и точную альтернативу традиционным методам секционирования и визуализации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Нейроиммунология
- Методы просветления тканей
Теоретическая база
- Изучает роль центральной нервной системы в когнитивных функциях.
- Исследует взаимодействие между головным мозгом, спинным мозгом и иммунной системой.
- Рассматривает фундаментальные вопросы, касающиеся нейроиммунной коммуникации.
Цель исследования
- Совершенствование методов исследования структур головного и спинного мозга.
- Облегчение картирования клеточных структур в интактных тканях.
- Снижение количества ошибок и сокращение времени обработки по сравнению с традиционными методами.
Используемые методы
- В исследовании применялся протокол просветления тканей для образцов головного и спинного мозга мыши.
- Для детального клеточного картирования использовались ткани всего головного и спинного мозга.
- Процесс включал несколько критических этапов, в том числе перфузию и фиксацию образцов, для сохранения флуоресцентных сигналов.
- Следовали систематическому подходу к заливке и визуализации образцов.
Основные результаты
- Протокол позволил успешно сохранить флуоресценцию для четкой визуализации нейронных структур.
- Были визуализированы детализированные нейронные структуры, что позволило получить данные о связях в головном и спинном мозге.
- Улучшенная визуализация позволила наблюдать отдельные меченные клетки, что способствовало более глубокому пониманию нейроанатомии.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует, что использование неповрежденных и просветленных образцов головного и спинного мозга может значительно улучшить качество визуализации.
- Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию нейроиммунных взаимодействий.
- Практическая значимость работы заключается в возможности дальнейшего изучения нейронных механизмов в условиях нормы и патологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Сохранение целостности связей между головным и спинным мозгом с помощью передовых методов просветления тканей позволяет проводить комплексное картирование нейронных и иммунных взаимодействий, что устраняет критический барьер при валидации мишеней в ЦНС. Данный протокол оптимизирует подготовку образцов и визуализацию, снижая вероятность ошибок ручного труда и ускоряя сбор данных для ранних этапов открытий и трансляционных исследований. Повышенная точность визуализации обеспечивает уверенность в прогнозных результатах механистических исследований и при приоритизации портфеля проектов в рамках программ нейроиммунологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает картирование нейронных цепей и иммунных интерфейсов в интактной ткани ЦНС с высоким разрешением.
- Поддерживает снижение механических рисков за счет сохранения пространственных взаимосвязей, критически важных для валидации мишеней.
- Облегчает проверку гипотез о нейроиммунных путях, имеющих значение для моделей заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых образцов целых органов для последующих этапов визуализации.
- Позволяет получать количественные данные высококонтентного имиджинга, подходящие для сравнительного анализа.
- Повышает готовность анализа за счет сохранения целостности флуоресцентного сигнала в процессе обработки.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует исследованиям систем, имеющих значение для патологий, обеспечивая визуализацию связей между ЦНС и иммунной системой.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации за счет сохранения анатомического контекста.
- Снижает трансляционный риск, позволяя более точно моделировать нейроиммунные механизмы.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол применяется на стыке этапов раннего поиска и доклинических исследований, обеспечивая поиск перспективных соединений-лидеров и изучение механизмов в области нейроиммунологии.
- Биология открытий: Совершенствует проверку гипотез и уточнение сигнальных путей, обеспечивая возможность анализа неповрежденных тканей.
- Скрининг: Стандартизирует подготовку образцов для получения воспроизводимых количественных данных визуализации.
- Аналитика: Предоставляет многоканальные данные визуализации высокого разрешения для проведения надежного статистического сравнения.
- Трансляционные исследования: Сохраняет анатомическую и молекулярную точность для согласования биомаркеров и моделирования заболеваний.
- Корпоративное использование: Создает масштабируемый, многократно используемый рабочий процесс по просветлению и визуализации тканей ЦНС для различных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней в ЦНС.
- Операционная ценность: оптимизирует обработку образцов, повышает воспроизводимость и обеспечивает возможность высокопроизводительного имиджинга.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних стадиях в портфелях по нейроиммунологии.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению активов в области ЦНС и иммуномодуляции.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области диссекции ЦНС, просветления тканей и передовых методов визуализации.
- Необходим доступ к специализированным платформам визуализации и аналитической инфраструктуре.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости протоколов подготовки образцов и визуализации.
- Может потребоваться адаптация под разные модели животных или типы тканей в зависимости от целей исследования.
- Потенциальные ограничения включают проблемы с сохранением целостности тканей и необходимость осторожного обращения для предотвращения затухания флуоресцентных сигналов.
