Экстракция и очистка тканей Подготовка образцов головного и спинного мозга мышей

Наше исследование сосредоточено на том, как центральная нервная система опосредует когнитивные функции и взаимодействует с иммунной системой. Мы стремимся усовершенствовать методы исследования головного и спинного мозга, решая фундаментальные вопросы об этих взаимодействиях. Эти методы сохраняют весь головной и спинной мозг неповрежденными, что помогает нам более тщательно картировать клетку с помощью очистки тканей. Кроме того, это делает процесс более быстрым и точным, сокращая время и количество ошибок по сравнению с традиционными методами секционирования и визуализации.

Мы составили карту областей головного и спинного мозга, соединенных с легкими. Наше исследование будет сосредоточено на изучении нейроиммунной связи между головным мозгом, спинным мозгом и легкими. И как это взаимодействие влияет на иммунные реакции.

[Инструктор] Для начала закрепите конечности мыши на широкой акриловой доске с помощью стальных зажимов. С помощью ножниц разрежьте кожу между двумя бедренными копытами и продолжайте резать вверх, пока не дойдете до диафрагмы. Раскройте обе стороны грудной клетки через диафрагму, используя ножницы и прямые щипцы для обнажения сердца. Введите инфузионную иглу диаметром 0,7 миллиметра, прикрепленную к перфузионной трубке, в левый желудочек и сделайте разрез на один-два миллиметра в придатке правого предсердия. После перфузии отделите кожу на спине и голове мыши с помощью офтальмологических ножниц. Разрежьте позвоночник в точке, где линия, соединяющая верхние задние края обеих конечностей, пересекается с позвоночным столбом. Удалите мышечную и жировую ткань с шеи и спины мыши, чтобы обнажить позвоночник и череп. Венозными ножницами разрежьте по средней линии промежуток между левой и правой сторонами позвоночника и спинного мозга от нижнего конца позвоночного канала. Затем удалите верхнюю часть и двусторонние стороны отрезанного позвоночника, чтобы обнажить спинной мозг. Повторяйте шаги до тех пор, пока не дойдете до соединения с мозгом. Поместите кончик одного лезвия венозных ножниц между большим затылочным отверстием и мозгом. Сдвиньте и разрежьте вдоль среднесагиттального шва, чтобы открыть череп. Используйте щипцы для удаления черепа и обнажения мозга. Теперь с помощью щипцов и венозных ножниц удалите ткань спинного мозга мыши с черепного конца. Используйте рассекающие щипцы для удаления оболочки спинного мозга под стереомикроскопом. Далее с помощью швов закрепите образец спинного мозга к фиксирующей пластине. Добавьте не менее чем в 20 раз больше объема образца 4% параформальдегида. После фиксации выбросьте параформальдегид и трижды промойте образец PBS. Для начала зафиксируйте извлеченный спинной мозг мыши в параформальдегиде. Для раствора для удаления липидов смешайте растворы А и В в соотношении по массе девять к одному. Добавьте 50 миллилитров раствора для удаления липидов в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров и поместите в нее неподвижную ткань. После инкубации в растворе С смените раствор и поместите чашку с культурой с образцом, полностью погруженным в раствор С, на световой короб с линией окалины. Для приготовления гелевого раствора в стеклянную бутылку объемом 200 миллилитров добавьте 147 грамм раствора С и три грамма агарозы. Хорошо перемешайте компоненты с помощью стержня для перемешивания, затем разогрейте в микроволновой печи, пока агароза не растворится. Переложите раствор геля в лабораторную печь, установленную на 37 градусов Цельсия. Налейте в форму слой темперированного геля глубиной два миллиметра 37 градусов Цельсия и охладите его в холодильнике при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут, пока он не станет полутвердым. Поместите соответствующий показатель преломления образец в форму, и добавьте раствор геля до уровня или немного ниже верхней части образца. Поместите форму обратно в холодильник с температурой четыре градуса Цельсия на два часа. Накройте крышкой и снова поставьте в холодильник. Снимите пинцетом крышку крышки и выньте внедренный образец. Добавьте 30 миллилитров раствора для визуализации в 50-миллилитровую трубку и погрузите образец в раствор. Нанесите клей 502, чтобы надежно прикрепить образец к держателю образца, прежде чем закрепить держатель на устройстве визуализации. Запустите программу сканирования и выберите уровень увеличения 4X в разделе увеличения. Нажмите кнопку калибровки, чтобы активировать режим калибровки. Нажмите кнопку предварительного просмотра, чтобы войти в режим предварительного просмотра. Затем нажмите кнопку движения в направлении Z, чтобы медленно перемещать образец вверх от нижней части камеры для образца, пока сгенерированный световой лист не пройдет через образец. Выберите подходящий лазерный канал и вариант режима подсветки. Выберите направление траектории сканирования для образца. Нажмите кнопку автоматического сканирования, чтобы начать съемку образца. Протокол успешно сохранил весь головной и спинной мозг мыши, сохранив при этом неповрежденные флуоресцентные сигналы для четкого изображения. Флуоресцентная визуализация образца головного и спинного мозга четко визуализировала детальные нейронные структуры. Изображения с большим увеличением обеспечили улучшенную визуализацию отдельных флуоресцентно меченых клеток.