Стратегия двойной CRISPR-интерференции для нацеливания на синтетические летальные взаимодействия между некодирующими РНК в раковых клетках

Наша цель состоит в том, чтобы систематически выявлять и терапевтически нацеливаться на критически важные сетевые концентраторы с акцентом на некодирующие РНК при раке. В настоящее время экспериментальная задача нашего подхода заключается в комбинаторной способности, необходимой для параллельной генерации и скрининга большого количества генов. Мы стремимся проложить путь к идентификации новых комбинаторных некодирующих РНК-мишеней или лекарственных структур для обхода резистентности и терапевтического ухода.

В будущем мы переведем этот инструмент для проверки концепции в крупномасштабные усилия по скринингу комбинаторных библиотек, возможно, в сочетании с РНК-связывающими белками, как in vitro, так и in vivo. Для начала подсчитайте клетки Lenti-X 293T HEK с помощью синего красителя Trypan в гемоцитометре. Планшет 4 раза по 10 в степени 6 клеток Lenti-X 293T HEK на 10-сантиметровую пластину и инкубировать для достижения примерно 80% слияния на следующий день.

Начиная с этого этапа, вы можете работать в лаборатории класса 2. Смешайте 500 микролитров подходящей трансфекционной среды с вектором переноса, плазмидой оболочки и вектором pPAX2. Выдерживайте смесь в течение пяти минут при комнатной температуре.

В отдельной пробирке смешайте 500 микролитров восстановленной сывороточной среды с 36 микролитрами реагента PEI в концентрации 1 миллиграмм на миллилитр. Выдерживайте смесь в течение пяти минут при комнатной температуре. Соедините две смеси и выдержите 15 минут при комнатной температуре.

Теперь осторожно, по каплям, добавьте смесь в клеточную среду, содержащую шесть миллилитров, и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе. Через 12–15 часов слейте среду в автоклавируемую бутылку для отходов с помощью серологической пипетки. Прополощите расходные материалы, в том числе серологические пипетки и наконечники для пипеток, дезинфицирующим раствором перед тем, как утилизировать их в отходах автоклава.

Добавьте пять миллилитров свежего DMEM в трансфицированные клетки с помощью новой пипетки. Для забора лентивирусов надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки переносят в каноническую пробирку объемом 50 миллилитров через 48 часов после трансфекции. Затем добавьте в клетки 5 миллилитров свежей среды и инкубируйте их в течение следующих 24 часов.

Храните тюбик в холодильнике. После инкубации повторите сбор лентивирусов и объедините его с образцом, собранным ранее. После третьего сбора урожая храните комбинированные надосадочные жидкости всех трех урожаев при температуре четыре градуса Цельсия до фильтрации и центрифугирования.

Комбинированную надосадочную жидкость центрифугировать в течение 5 минут при температуре 500 G и 4 градусах Цельсия в аэрозоленепроницаемых контейнерах и роторах, одобренных для организмов группы риска 2, затем отфильтровать надосадочную жидкость через стерильные шприцевые фильтры класса 0,2 микрометра для стерильных клеточных культур. Сконцентрируйте отфильтрованную надосадочную жидкость при температуре 1000G и четырех градусах Цельсия с помощью центробежной фильтрующей установки с отсечкой молекулярной массы 100 килодальтон примерно до 500 микролитров. Хранить вирусные аликвоты от 50 до 100 микролитров при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего использования.

Планшет 501-мел помещают клетки в шестилуночный планшет в 2 раза по 10 в степени 5 клеток на лунку с конечным объемом культуры 2 миллилитра за сутки до трансдукции. Замените питательную среду 2 миллилитрами предварительно подогретого DMEM с добавлением полибрена в концентрации 6 мкг на миллилитр конечной концентрации. Начиная с этого этапа, работайте в лаборатории класса 2.

По 50 микролитров готовых лентивирусов SPD и SAD одновременно добавляйте в клетки по каплям. Осторожно встряхните тарелку и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с содержанием углекислого газа 5%. Через 16 часов после трансдукции сбросить среду в автоклавируемый флакон с помощью серологической пипетки.

Добавьте 2 миллилитра свежей среды, содержащей 10 микрограмм на миллилитр бластицидина и 2 микрограмма на миллилитр пуромицина. Повторите этап замены среды через два дня и обрабатывайте трансдуцированные клетки в условиях S1 через семь дней после трансдукции. Затравите 0,1 умножить на 10 в степень 5 клеток, содержащих стабильно трансфицированные SadCas9 KRAB и Sp-dCas9-KRAB, через семь дней после трансдукции в 96 луночный планшет со 100 микролитрами предварительно подогретого DMEM.

В день трансдукции замените среду на 100 микролитров предварительно подогретого DMEM с добавлением полибрена в соотношении 6 микрограмм на миллилитр. Добавьте к клеткам соответствующий объем лентивирусов и инкубируйте планшет. Через 16 часов замените среду свежей средой, содержащей зеоин, бластицидин и пуромицин.

Выполните обнаружение люминесценции через пять дней после трансдукции с помощью анализа жизнеспособности клеток в соответствии с инструкциями производителя. Западный анализ крови подтвердил успешную экспрессию гибридных белков SpdCas9 и SadCas9 в клетках трансдуктора 501-mel. Количественный анализ полимеразной цепной реакции показал эффективный нокдаун отдельных длинных некодирующих РНК RP11 и XLOC с использованием специфических направляющих РНК, но только пара XLOC-sa и RP11-sp успешно подавляла обе мишени одновременно.

Двойная репрессия RP11 и XLOC с использованием пары XLOC-sa и RP11-sp GRNA значительно снижала жизнеспособность клеток 501-mel до 59% по сравнению с контролем.