Эффективный метод извлечения эпителия фаллопиевых труб человека для анализа отдельных клеток

Наши исследования сосредоточены на понимании и борьбе с химиорезистентностью при раке яичников. Мы стремимся обнаружить механизмы и клеточные субпопуляции, вызывающие резистентность, и новые мишени для искоренения этих агрессивных популяций.

Секвенирование РНК одиночных клеток облегчает характеристику субпопуляций в гетерогенных опухолях яичников. Мы используем нераковые эпителиальные клетки фаллопиевых труб в качестве клеток нормального происхождения для анализа рака яичников.

Эффективная изоляция эпителиальных клеток фаллопиевых труб в обогащенную одноклеточную суспензию поможет в дальнейшем понимании инициации высокодифференцированного серозного рака яичников. Этот метод механического и ферментативного расщепления обеспечивает более эффективный процесс экстракции обогащенной одноклеточной суспензии жизнеспособных эпителиальных клеток фаллопиевых труб.

[Рассказчик] Для начала соберите свежие человеческие фаллопиевы трубы в 15 или 50 миллилитровую пробирку, содержащую диссоциативную среду, и поместите трубку на лед. Переложите фаллопиевы трубы в стерильную чашку Петри, содержащую свежие диссоциативные среды, и поместите образец под препарирующий микроскоп. Теперь с помощью тонких щипцов и ножниц Ваннаса-Тюбингена удалите жир, соединительную ткань и любые сосуды, окружающие трубки. Затем прорежьте ножницами корональную плоскость маточных труб, чтобы сформировать небольшие цилиндры диаметром от трех до пяти миллиметров. Используйте щипцы fine=point для стабилизации ткани во время разреза. Осторожно отсасывайте диссоциативную среду из чашки, содержащей кусочки ткани. Промойте кусочки салфетки два раза двумя миллилитрами холода 1x PBS и слегка поверните пластину. После аспирации PBS инкубируйте кусочки ткани в течение пяти минут в холодном пятимиллимолярном ЭДТА при комнатной температуре. Суспензируйте фрагменты ткани в холодном 1% растворе трипсина Хэнкса и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 40 минут. Аспирируйте 1% сбалансированный солевой раствор Трипсина Хэнкса и дважды промойте кусочки ткани в холодной диссоциативной среде, чтобы инактивировать трипсин. Инкубируйте фрагменты ткани в двух миллилитрах диссоциативной среды с 0,4 мг ДНКазы в течение не менее 30 минут при комнатной температуре. Под препарирующим микроскопом, еще находясь в среде ДНКазы, удерживайте фрагмент фаллопиевой трубы щипцами так, чтобы просвет был параллелен дну чашки. С помощью щипцов многократно надавливайте на ткань, чтобы изгнать эпителиальные клетки из просвета. Подтвердите выделение ореола клеток вокруг ткани. Переложите клетки, содержащие среду, в стерильную 15-миллилитровую пробирку. Дважды вымойте чашку Петри диссоциирующими средами и объедините промывки в одной пробирке. Выбросьте оставшиеся фрагменты стромальной трубки. Чтобы собрать клетки, центрифугируйте их при 500 г в течение пяти минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре диссоциационной среды. Теперь смешайте 10 микролитров клеточной суспензии с равным объемом трипанового синего. Нанесите пипеткой 10 микролитров смеси в камеру счетного стекла и вставьте ее в счетчик клеток для определения количества клеток. Ресуспендируйте клетки в девяти миллилитрах диссоциативной среды, содержащей коллагеназу первого типа и ДНКазу. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30–45 минут в орбитальном вибростенде, настроенном на 200 об/мин. Чтобы собрать клетки, центрифугируйте при 500г в течение пяти минут. После аспирации надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах диссоциационной среды, чтобы смыть коллагеназу. Пропустите клеточную суспензию через 100-микрометровое сетчатое фильтр в 50-миллилитровую пробирку и центрифугируйте фильтрат при плотности 500 г в течение пяти минут. Если клеточная гранула выглядит красной, приготовьте буфер для лизиса эритроцитов для лизиса эритроцитов. Отсадите среду из гранулы, добавьте пять миллилитров разбавленного буфера для лизиса эритроцитов и инкубируйте образец на льду в течение трех минут. Чтобы остановить лизис эритроцитов, добавьте в пробирку 45 миллилитров 1x PBS. Центрифугируйте пробирку при 500г в течение пяти минут. После сбора и повторного суспендирования клеток в одном миллилитре диссоциационной среды смешайте 10 микролитров клеточной суспензии с равным объемом трипанового синего. Нанесите пипеткой 10 микролитров смеси в камеру счетного стекла и вставьте ее в ячейку счетчика. Анализ проточной цитометрии подтвердил выделение жизнеспособной и обогащенной популяции эпителиальных клеток из ткани маточной трубки со средней жизнеспособностью 82%. После выделения CD45-положительных иммунных клеток, EpCAM-положительные эпителиальные клетки составляли в среднем 80% образца, в то время как контаминация CD10-положительных стромальных клеток была минимальной и составляла 7,8%. Изолированные эпителиальные клетки образовывали адгезивные булыжные кластеры в 2D-культуре после четырех-шести дней осаждения, подтверждая идентичность эпителия. Иммунохимия показала, что большинство культивируемых клеток экспрессировали EpCAM и PAX8 только с небольшим количеством виментин-положительных клеток. В культуре присутствовали реснитчатые клетки.