Высокопроизводительный метод наблюдения за фенотипами подвижности у Pseudomonas aeruginosa

Наши исследования сосредоточены на изучении того, как работают бактерии и вызывают инфекции, используя системную биологию и геномику. Наша цель — выявить гены, влияющие на физиологию бактерий в условиях, имитирующих инфекционную среду, чтобы найти новые цели для разработки лучших антибиотиков и альтернативных методов лечения. Мы разработали высокопроизводительный протокол для выявления генетических факторов, влияющих на подвижность Pseudomonas aeruginosa, что позволяет анализировать поведение роя и подёргивания по всему геному. Эта исследовательская инициатива выявила молекулярные механизмы, управляющие подвижностью, которые также способствуют формированию биопленки, колонизации и уклонению от защиты хозяина.

Он адаптируется к различным анализам и видам бактерий. Для начала возьмите исходные пластины из библиотеки мутантов Pseudomonas aeruginosa transposon и оставьте их плоскими на поверхности при комнатной температуре примерно на час для охлаждения. Для желаемого анализа выберите пластины M9 глюкозы 0,5% агаров для роя и пластины LB agar 1%agar для подёргивания.

Чтобы настроить репликатор для точного переноса колоний, включите репликатор. В разделе «Выбор и режим работы» выберите «Выбор» и запустите сохраненные программы. В разделе выберите исходные номера, выберите плюс пластину 384 агар.

Затем, в разделе select target plate, выберите плюс пластину 384 agar. В разделе select pads выберите короткий контакт 384. В программах Singer выберите replicate many, затем перейдите к replicate program options и выберите general, recycle и none.

В исходном разделе выберите смещение, затем случайный и стандартный радиус. В целевом разделе выберите закрепление и отрегулируйте давление на 2%. Оставьте все остальные настройки по умолчанию. Затем вставьте короткий штифт RePads 384 в соответствующий отсек.

Разместить исходную и целевые пластины на назначенной платформе репликатора. Поставьте на платформу исходные пластины с плотностью 384 и пустые пластины подвижности. Нажмите run, используя выбранные параметры, чтобы начать процесс передачи.

Микробный робот для закрепления микробного массива перенесёт колонии с 384 плотностных источников на пластины подвижности. После этого поместите инокуленные пластины подвижности в пластиковые пакеты. Аккуратно положите пакеты с тарелками в инкубатор, установив на 37 градусов Цельсия на 18 часов.

После инкубационного периода сделайте высококачественные изображения пластин подвижности с помощью любого высококачественного программного обеспечения для визуализации. После проведения теста на подвижность и визуализации пластин подвижности запустите макро в ImageJ. Откройте папку с изображениями, чтобы загрузить пакет для анализа.

При запросе изменяйте угол с помощью опции предварительного просмотра, пока пластина не станет ровной, чтобы регулировать её вращение. Когда вы будете довольны, нажмите кнопку «ок». Затем переместите инструмент прямоугольника по колониям, чтобы обрезать часть пластины, содержащую колонии.

Когда будете готовы, нажмите OK, чтобы завершить обрезку. Определите сетку, используемую для отображения интересующей области, или ROI, вокруг каждой колонии и измерьте площадь подвижности. Выберите соответствующую плотность колонии и отрегулируйте параметры по мере необходимости, чтобы каждый круг располагался вокруг колонии.

Когда будете готовы, активируйте окно OK и нажмите кнопку OK. Область подвижности каждой колонии будет измерена, и CSV-файл с данными будет сохранен в назначенной папке. Для анализа подвижности автоклав — агарный раствор, содержащий M9, глюкозу, казаминокислоты и сульфат магния.

Налейте 25 миллилитров охлаждённого, смешанного агара в каждую пластину Петри. Затем инокулируйте каждую тарелку 2,5 микролитрами ночной бактериальной культуры и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 18 часов с крышками, направленными вверх, чтобы наблюдать фенотипы подвижности. После автоклавирования раствора LB с 1%агаром залить 25 миллилитров охлаждённого, смешанного LB 1%агар в пластины Петри.

Введите бактерии в дно подёргивающихся пластин, содержащие 1% агар. Инкубировать тарелки при 37 градусах Цельсия в течение 48 часов, а затем при комнатной температуре ещё 48 часов. После инкубации аккуратно вынимите агар из тарелок.

Визуализируйте зону подёргивания, окрашивая чашку Петри раствором 1% кристаллического фиолетового цвета. Анализ подвижности подёргивания показал, что мутанты Pseudomonas aeruginosa с удалением генов машины T4P демонстрируют значительно меньшие участки гало по сравнению с диким типом, что указывает на снижение подвижности подёргивания. Анализ роевой подвижности показал, что мутанты с делецией библиотеки PA14 имели значительно уменьшение областей гало без выступов, что подтверждает дефектную способность к рою.

Исследования подвижности бактерий часто ограничены их пропускной способностью. Наш протокол высокой пропускной способности поможет исследователям всесторонне изучать подвижность бактерий. Например, используя общегеномную коллекцию мутантов, становится возможным выявить все гены, связанные с подвижностью, и выяснить, как бактерии вызывают инфекции.

Наши результаты поднимают новые вопросы о генетическом контроле подвижности у Pseudomonas aeruginosa, её роли в формировании биопленки и связи с патогенезом. Они также помогают в изучении того, как условия окружающей среды формируют поведение подвижности и могут ли таргетирование генов подвижности привести к инновационным антимикробным терапиям.