Оптимизация доставки внеклеточных везикул с помощью каркаса с 3D-биопечатью для лечения хронических ран

Объем исследований заключается в разработке усовершенствованной конструкции биоактивной повязки на рану для эффективного лечения хронических ран. Каркас будет обеспечивать контроль, деградацию и эффективную локальную доставку внеклеточных везикул.

Текущий протокол направлен на преодоление ограничений обычной повязки на рану в лечении хронического воспаления. В частности, отсутствие контроля, деградация и своевременное высвобождение внеклеточных везикул.

Этот протокол предлагает подход Tuneable для своевременной доставки терапевтических агентов, включая гены, для различных применений.

Все результаты позволяют по-новому взглянуть на адаптацию каркаса для различных типов ран и улучшить регенеративную терапию за счет загрузки внеклеточных везикул определенными биологически активными молекулами.

Наша лаборатория собирается создать трансляционную исследовательскую платформу для решения проблемы заживления диабетических ран.

[Рассказчик] Для начала быстро разморозьте флакон с мезенхимальными стволовыми клетками на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Снимите флакон, когда останется небольшой осколок льда. Переложите все содержимое флакона с мезенхимальными стволовыми клетками в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую полную среду. Центрифугируйте клетки при 200 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре предварительно прогретой полной среды. Затем переложите клетки в колбу Т25, содержащую четыре миллилитра готовой среды. Осторожно наклоните колбу T25, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек. Инкубируйте колбу при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Когда клетки достигнут от 70% до 80% слияния, отсасывайте отработанную среду из колбы Т25. Добавьте в колбу три миллилитра свежего PBS, чтобы удалить остатки клеток. Далее добавьте в колбу один миллилитр 0,25% раствора трипсина и инкубируйте. Контролируйте отслойку клеток под микроскопом при 4-кратном увеличении. Теперь добавьте четыре миллилитра предварительно теплой, полной среды в колбу и пипеткой вверх и вниз по поверхности до отслоения. Затем переложите клеточную суспензию в центрифугу объемом 15 миллилитров два. После центрифугирования повторно суспендируйте клеточную гранулу в свежей готовой среде и подсчитайте клетки. Затем переложите ячейки в колбу Т75 с плотностью затравки 5 000 ячеек на квадратный сантиметр. Инкубируйте колбу T75 при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Через 72 часа соберите кондиционированную среду из клеток для выделения внеклеточных везикул. Чтобы изолировать внеклеточные везикулы или ВВ, центрифугируйте 13 миллилитров собранной кондиционированной среды при 800 G в течение 15 минут для удаления клеточного мусора. Используйте шприцевой фильтр 0,22 микрометра для фильтрации надосадочной жидкости и удаления крупных частиц. Теперь добавьте в отфильтрованную кондиционированную среду пять миллилитров буфера для осадков. Тщательно перебейте смесь в вихрь, чтобы она была однородной. Инкубируйте смесь в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы дать возможность внеклеточным пузырькам выпасть в осадок. Затем центрифугируйте смесь при 3220 г в течение 30 минут при 20 градусах Цельсия. Обеспечение балансировки трубок. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулу, и снова центрифугируйте в течение пяти секунд. Теперь аккуратно суспендируйте гранулу EV в 200 микролитрах PBS, чтобы не повредить везикулы. Выполните вестерн-блоттинг для обнаружения маркеров, специфичных для внеклеточных везикул, включая CD63, CD81 и CD9. Приготовьте свежий 4,5% раствор альгината натрия в стерильной сверхчистой воде. Перемешайте раствор в течение ночи при температуре 60 градусов Цельсия, чтобы обеспечить полное растворение. Затем растворите карбоксиметилцеллюлозу в стерильной сверхчистой воде до получения 3,8% раствора. Центрифугируйте подготовленные биочернила при температуре 3 220 г в течение 10 минут при температуре 25 градусов Цельсия, чтобы удалить пузырьки, которые могут помешать процессу печати. Теперь с помощью шприцевого миксера смешайте три миллилитра приготовленного раствора альгината натрия с маркировкой EVs или контрольной дозой Dialymmi. Аккуратно хорошо перемешайте, чтобы обеспечить равномерную суспензию. С помощью другого шприцевого миксера соедините один миллилитр карбоксиметилцеллюлозы со свежеприготовленным раствором альгинатной лиазы в стерильной сверхчистой воде для достижения конечной концентрации 0,5 миллиединиц на миллилитр. Одновременно загрузите биочернила альгината натрия EV в основную часть и биочернила альгината карбоксиметилцеллюлозы Lyase в оболочку шприца. Запустите программное обеспечение для 3D биопринтера. Выберите цилиндрическую форму с диагональным заполнением для создания структуры леса. Установите диаметр цилиндра на 20 миллиметров и высоту на 1,1 миллиметра. Настройте размер пор с точностью до одного миллиметра. Установите скорость откачки ядра и форсунки оболочки на один миллиметр в секунду при толщине 0,25 миллиметра на слой. Настройте скорость перемещения с точностью до шести миллиметров в секунду и печатайте четыре слоя при комнатной температуре. Используйте увлажнитель воздуха с аэрозольным хлоридом кальция для сшивания каркаса в процессе экструзии. Начните печать скаффолда на полиэфирной пленке. Расположите сопло увлажнителя примерно в 20 сантиметрах от экструзионной головки, чтобы обеспечить эффективную сшивку. Погрузите каркас в 2,2% раствор хлорида кальция на 10 минут для завершения сшивки. Трижды промойте каркас стерильной сверхчистой водой, чтобы удалить избыток хлорида кальция и несвязанные биочернила. Побрейте тыльную сторону кожи мыши с диабетом OCTA, находящейся под наркозом, с помощью электрической машинки для стрижки, избегая раздражения кожи или травм. Теперь создайте шестимиллиметровую круглую кожную рану полной толщины на тыльной поверхности каждой мыши. Аккуратно положите на раневое ложе 3D-биопечатный каркас, содержащий внеклеточные везикулы, меченные PGH. Убедитесь, что каркас полностью покрывает поверхность раны, и слегка надавите стерильными щипцами, чтобы свести к минимуму воздушные карманы. Перенесите мышей под наркозом в систему визуализации IVIS через два, четыре, восемь часов и 24 часа после имплантации. В мастере визуализации выберите опцию флуоресцентной визуализации и активируйте фильтры возбуждения и излучения для красителя PKH. Отрегулируйте параметры камеры, включая поле зрения и высоту объекта, чтобы оптимизировать обнаружение сигнала. Начните получение изображений, сохраните полученные данные. Затем выпустите флуоресцентные сигналы от маркированных электромобилей. Альгинатные EV в альгинатном лиазовом скаффолде карбоксиметилцеллюлозы демонстрировали более быстрый профиль высвобождения по сравнению с альгинатными EV только в карбоксиметилцеллюлозе, особенно в двух- и четырехчасовых временных точках.