Создание трехмерного кокультурного модуля эпителиальных клеток с использованием нановолокнистых мембран

Наша исследовательская группа использует поливиниловый спирт, ПВА и полиэпсилон-капролактон, PCL, нановолокнистые мембраны для разработки 3D-системы кокультуры. Он направлен на то, чтобы ответить на вопрос о том, как мембраны поддерживают эпителиальные клетки и клетки фибробластов, имитируют тканевые среды и облегчают изучение паттернинга, сигналов и клеточных взаимодействий. Мы покажем, что пористые нанофиброзные мембраны с электроспиннингом позволяют эпителиальным клеткам формировать эпителиальную ткань, позволяя многослойностям расти и фибробластам в каждом дополнительном матриксе.

Эти методы показывают, как расширенная 3D-система может обеспечить растущие ткани лучшими средами по сравнению с традиционными 2D-культурами. Мы предлагаем систему кокультуры с использованием дифференцированных эпителиальных клеток. Организация с использованием стволовых клеток требует сложной процедуры дифференцировки, но наша модель имеет преимущества в простоте и экономии времени при разработке 3D-системы кокультуры.

Мы фокусируемся на преодолении ограничений нановолокнистых каркасов путем комбинирования нановолокнистых мембран с надслойными гидрогелями в кокультурах. Для начала добавьте 0,02 грамма полиакриловой кислоты и один грамм ПВА в чистую стеклянную бутылку, содержащую магнитный стержень. Добавьте в бутылку 7,8 миллилитров дистиллированной воды, затем поставьте бутылку на тарелочную мешалку.

Как только бутылка остынет до комнатной температуры, добавьте в нее 0,2 миллилитра глутаральдегида и поставьте обратно на мешалку для тарелки при 500 об/мин на 30 минут при комнатной температуре. Используйте пятимиллилитровый шприц для электроспиннинга. Отделите поршни от бочек и очистите мелкий пластиковый мусор внутри бочек и кончиков плунжеров.

Затем с помощью игл блокируйте поток жидкости и налейте раствор ПВА в каждый цилиндр шприца. Соберите поршни в бочки и снимите иглы. После сборки новой металлической иглы 27 калибра поместите ее в электроспиннинговую машину.

Плотно оберните коллектор алюминиевой фольгой. Как только панель инжектора вернется в исходное положение, установите электроспиннинговую машину на объем впрыска два миллилитра, скорость впрыска шесть микролитров в минуту, скорость ролика 100 об/мин и расстояние от наконечника до коллектора 14 сантиметров. Проверьте расход жидкости для каждого насоса, затем запустите электропрядильную машину с электрическим потенциалом примерно 12 киловольт.

После завершения процесса электроспиннинга отсоедините фольгу, содержащую волокнистый коврик, от коллектора. Храните коврик из нановолокна в адсорбенте под вакуумом. Добавьте в чистую стеклянную бутылку 1,5 грамма PCL и 8,5 миллилитров хлороформа.

Поместите бутылку на тарелочную мешалку и растворите PCL в хлороформе в течение 12 часов при комнатной температуре. Отрежьте небольшой кусочек мембраны из нановолокна, покройте кусочки тонким слоем золота с помощью процесса автоматического распыления в течение пяти минут. Для начала разрежьте изготовленный коврик из нановолокна ПВА на кусочки нужного размера для вкладыша transwell.

Приготовьте небольшую посуду, содержащую 1,5 миллилитра чистой соляной кислоты. Поместите чашку с соляной кислотой и кусочками нановолокна в вакуумную камеру и закройте крышку. Затем откройте клапан, подключенный к вакуумному насосу, и подождите 10 секунд, пока пары соляной кислоты не поднимутся.

Закройте клапан и обработайте мембраны парами соляной кислоты в течение двух минут. После обработки соляной кислотой добавьте капли дистиллированной воды на мембраны. Поместите мембраны на предметное стекло и снимите их с фольги.

Используйте машину для нанесения покрытий с автоматическим напылением, чтобы покрыть мембраны углеродной лентой тонким слоем золота. Затем наномембраны ПВА трижды промывают сшитыми соляной кислотой с ПБС и замачивают их в питательных средах. После замачивания проверьте рН, чтобы подтвердить отсутствие остаточной соляной кислоты.

Для начала разрежьте маты из нановолокна на круглые кусочки диаметром 10 миллиметров для наномембран PVA и 13 миллиметров для наномембран PCL. Смешайте основание SYLGARD 184 и отвердитель в соотношении 10 к одному в пластиковом стаканчике. Используйте чистое предметное стекло, чтобы энергично перемешать полидиметилсилоксан или раствор PDMS в течение двух-трех минут, пока не образуются пузырьки.

Равномерно распределите PDMS на предметном стекле. Хорошо окуните нижний край вкладыша в PDMS. Затем поместите вставку хорошо вверх дном на нагреватель слайдов на 10-15 минут, пока PDMS не затвердеет.

Проверьте PDMS с помощью наконечника для дозатора объемом 200 микролитров, чтобы убедиться, что он больше не липкий. Теперь аккуратно прижмите вставку к наномембране ПВА так, чтобы нижняя часть вставки хорошо смотрела на сторону мембраны, состоящую из нановолокна. Добавьте каплю дистиллированной воды в центр лунки и с помощью щипцов аккуратно снимите фольгу.

Затем хорошо поместите вставку в новую 24-луночную пластину и дайте мембране высохнуть. При прикреплении наномембранного элемента окуните наконечник пипетки объемом 200 микролитров в смесь PDMS и точно расставьте точки по четырем углам и центру лунки. Поместите пластину на нагреватель слайдов и дайте PDMS застыть в течение пяти-семи минут.

Затем поместите фрагмент наномембраны PCL в колодец, содержащий PDMS, со стороной нановолокна, прикрепленной к PDMS. С помощью небольшой чистой щетки слегка прижмите фольгированную сторону мембраны для полного крепления. Затем добавьте в лунку 0,2 миллилитра 70%-ного этанола, чтобы облегчить удаление фольги.

Простерилизуйте вставку и дно колодца в колодце под ультрафиолетовым светом в течение ночи. На следующий день хорошо промойте вкладыш и дно, добавив 200 микролитров PBS во вкладыш и 500 микролитров на дно в течение трех циклов по 10 минут каждый. Как только клетки достигнут 70-80% конфлюенции, промойте их 10 миллилитрами PBS и добавьте два миллилитра 0,05% трипсина ЭДТА, чтобы трипсинизировать.

Осторожно постучите по тарелке, чтобы выбить ячейки со дна. Добавьте восемь миллилитров полной питательной среды, чтобы нейтрализовать фермент трипсин, затем перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте пробирку при 400G в течение пяти минут.

После удаления наднатанта повторно суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах полного DMEM с средой F12. Затем заполните дно лункой на 500 микролитров полного материала DMEM F12. Перенесите прилагаемую нановолокнистую мембрану ПВА на трансвелл и добавьте 50 микролитров клеточной суспензии MLE-12.

Затем заполните нижнюю лунку прикрепленной нановолокнистой мембраны PCL 500 микролитрами клеточной суспензии NIH3T3. После инкубации клеток в течение двух часов соберите ячейку MLE-12, содержащую вкладыш, и ячейку NIH3T3, содержащую нижнюю лунку, в установке transwell, пространственное распределение клеток NIH3T3 и клеток MLE-12 в системе кокультуры было четко различимым, при этом зеленые клетки NIH3T3 были диспергированы на разной глубине, а красные клетки MLE-12 образовывали слои. Клетки NIH3T3 проникают в нановолокнистую мембрану PCL и распространяются вдоль осей нановолокна, в то время как клетки MLE-12 прилипают к поверхности нановолокнистой мембраны PDA и демонстрируют агрегацию.