Генерация трехмерных сфероидов/органоидов из двумерных клеточных культур с использованием нового штампового устройства

Целью наших исследований является создание эффективного и воспроизводимого протокола для создания трехмерных клеточных культур с использованием инновационной ступенчатой системы микролунок в агарозных формах. Мы стремимся ответить на вопрос, как создать упрощенную, контролируемую среду, способствующую созданию однородных, высококачественных 3D-культур для тестирования лекарств, генной инженерии и связанных с ними приложений. Последние достижения в области систем 3D-культивирования клеток улучшают клеточные взаимодействия и создают больше сред, подобных vivo.

Такой подход способствует образованию сфероидных органоидов, что делает его многообещающим инструментом для биомедицинских исследований. Современные технологии для 3D-клеточных культур включают в себя висячие капли, вращающиеся клеточные культуры, пластики с низким уровнем прикрепления, пластины с коническими лунками, микропористые каркасы, магнитные шарики и гидрогели без каркасов. Эти методы позволяют формировать 3D-клеточные структуры, каждая из которых имеет свои преимущества и ограничения.

Наш протокол решает проблему создания однородных 3D-сфероидов и органоидов с постоянным размером и качеством в больших масштабах. Он решает проблемы жизнеспособности и плотности клеток, трудности и нестабильность во время процесса, оказываясь экономически эффективным, воспроизводимым решением для надежных 3D-исследований клеточных культур. Мы стремимся к совершенствованию исследовательских инструментов, созданию сфероидов органоидов инсулин-продуцирующих бета-клеток для анализа in vitro и инкапсуляции в биополимеры, с целью реверсии диабета I типа и генерации сфероидов органоидов из трижды негативных клеток рака молочной железы человека в качестве платформы для скрининга лекарств перед лечением пациента.

Спроектируйте штемпельное устройство с помощью указанного программного обеспечения. Промойте изготовленный на заказ штамп губкой с мягкой щетиной и дистиллированной водой, чтобы удалить остатки. Подвергните чистый штамп воздействию ультрафиолета на пять-10 минут, чтобы обеспечить стерильность.

Чтобы приготовить от 1 до 2% раствора агарозы, взвесьте необходимое количество чистого порошка агарозы и растворите его в PBS. Нагрейте раствор в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Затем пипеткой впрысните примерно три миллилитра 40-градусного раствора агарозы в каждую лунку шестилуночного планшета.

Поместите штамп в центр лунки и дайте агарозе застыть в течение 5-10 минут. После затвердевания удалите штамп легкими движениями вперед и назад, чтобы выпустить вакуум, не повреждая микролунки. Трижды промойте микролунки PBS для удаления остатков.

Подвергните пластину воздействию ультрафиолета в течение 10 минут, чтобы устранить микробное загрязнение. Добавьте три миллилитра питательной среды в каждую лунку из шести лунок планшета и инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с углекислым газом. Чтобы получить однородную суспензию островков поджелудочной железы свиней, добавьте трипсин в двумерную клеточную культуру для диссоциации клеток.

Затем подсчитайте ячейки и отрегулируйте концентрацию, чтобы достичь желаемого количества клеток на микролунку шестилуночного планшета. Пипеткой нанесите три миллилитра клеточной суспензии на агарозные микролунки и покрутите пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение. Дайте клеткам осесть под действием силы тяжести в течение 10-15 минут.

Затем понаблюдайте за поселившимися клетками под микроскопом. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с содержанием углекислого газа 5%. Каждые два-три дня заменяйте 50% старого или отработанного носителя свежим носителем.

Продолжайте культивирование до тех пор, пока полностью не сформируются компактные, трехмерные структуры. Чтобы собрать сфероиды или органоиды, удалите питательную среду и с помощью отрезанного наконечника пипетки соберите трехмерные структуры с помощью энергичного пипетирования. Компактные трехмерные структуры были успешно сформированы после 48 часов культивирования в агарозных микролунках, что наблюдалось при агрегации клеток, зависящей от времени.

Жизнеспособные трехмерные структуры сохранялись при удалении из агарозных микролунок с зеленым окрашиванием, указывающим на живые клетки внутри структур, подтверждающим жизнеспособность и стабильность клеток.