Анизотропия флуоресценции с временным разрешением из одиночных молекул для характеристики локальной гибкости биомолекул

Данное исследование направлено на изучение локальной гибкости и динамики биомолекул на уровне отдельных молекул с использованием анизотропии флуоресценции с временным разрешением в режиме конфокальной микроскопии. Обнаружение и локализация отдельных молекул позволили наблюдать за биомолекулами, однако для отслеживания их динамики требуются другие подходы. Методы флуоресценции с временным разрешением помогают заполнить этот пробел.

Общие инструменты для экспериментального изучения биомолекулярной динамики, включая одиночные молекулярные лады и ЯМР. На уровне одной молекулы, различные анализы, процессы, фотонное флуоресцентное излучение, включают анализ с временным разрешением и дисперсионный анализ всплесков.

Использование нескольких флуорофоров для экспериментов с smFRET может усложнить планирование эксперимента и создание образцов достаточно хорошего качества. Использование одной метки и анизотропия флуоресценции решают некоторые из этих сложностей.

Мы обнаружили, что мономерная форма вилкоголового домена FoxP1 человека ведет себя как неупорядоченный белок и увеличивает свою сворачивающуюся популяцию при димеризации.

[Инструктор] Для начала отфильтруйте приготовленный стандартный буферный раствор через фильтр размером пор 0,22 мкм. Затем отфильтруйте стандартный буфер через угольный фильтр для получения одной молекулы. Для флуоресцентных щупов приготовьте небольшие по объему аликвоты приготовленного флуоресцентного про BODIPY Fluorescent Pro. Для калибровки установки с поляризационным разрешением, во-первых, включите параллельный и перпендикулярный каналы детектора и включите синий лазер. Убедитесь, что мощность лазера установлена на 60 микроватт, и откройте программную панель управления с коррелированным временем подсчета однофотонных средств или программную панель TCSPC. Далее смешайте один микролитр 100 наномоляров Родамина 110 с 49 микролитрами дистиллированной воды. Добавьте каплю иммерсионной жидкости на верхнюю часть линзы объектива микроскопа. Поместите защитное стекло на объектив микроскопа и убедитесь, что капля воды находится по центру объектива. Добавьте 50 микролитров разбавленного раствора Родамина 110 в центр покровного стекла для калибровочных измерений. Отрегулируйте плоскость изображения так, чтобы она находилась внутри раствора и над поверхностью стекла. С помощью ручки фокусировки найдите вторую яркую точку фокусировки и отрегулируйте ее на 1 1/2 оборота. Теперь откройте программу в режиме Time-Tagged Time-Resolved и нажмите кнопку СТАРТ. Запишите скорость подсчета в течение 120 секунд. Для фоновых измерений добавьте 50 микролитров дистиллированной воды в центр покровного стекла и повторите сбор. Запишите скорость подсчета фотонов в течение 300 секунд и сохраните файл как water.ptu. Для дополнительных фоновых измерений добавьте в центр покровного стекла 50 микролитров стандартного буфера. Запишите скорость подсчета фотонов в течение 300 секунд и сохраните файл как standard_buffer.ptu. Теперь запустите программное обеспечение для анализа Burst Integration Fluorescence Lifetime, BIFL, и нажмите «Подтвердить настройку» в автоматическом окне. Затем нажмите «Получить параметры из файла», затем нажмите «ОК». Чтобы выбрать измерение для анализа, нажмите на Data Path Array и выберите соответствующий набор данных. Теперь загрузите файл измерения воды water.ptu для массивов, таких как Green Scatter, файл standard_buffer.ptu для зеленого фона и Rhodamine110.ptu для зеленого толстого. в параметрах выделения одной молекулы нажмите «Далее», затем «Настроить», чтобы открыть новое всплывающее окно. Затем нажмите Порог, чтобы изменить время прибытия межфотонов и выбрать время события одной молекулы в качестве среднего времени прибытия межфотонов. Теперь нажмите на минимальное число, чтобы установить минимальное количество фотонов на событие одной молекулы. Затем закройте всплывающее окно, нажав Return и OK. Нажмите на Color Fit, чтобы настроить начальное время жизни флуоресценции для зеленого и других цветов с помощью параметров затухания флуоресценции. Изменяйте, запрашивайте и задерживайте значения, регулируя значения from и to, и закройте всплывающее окно. Наконец, нажмите кнопку «Сохранить», чтобы обработать файлы ASCII и сохранить их в выбранной папке. Перенесите на ночь предварительный инокулянт Escherichia coli C41 в 500 миллилитров LB среды с предварительно добавленным антибиотиком в соотношении разведения 1:500. Измерьте поглощение культуры на 600 нанометрах, чтобы контролировать рост культуры. Когда оптическая плотность достигнет от 0,5 до 0,7, добавьте IPTG до конечной концентрации 0,5 миллимоляра, чтобы вызвать экспрессию белка, и инкубируйте. Центрифугируйте бактериальные клетки при 3000 г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия, когда оптическая плотность культуры достигнет от 1,4 до 1,6. Выбросив надосадочную жидкость, храните гранулу при температуре минус 20 градусов Цельсия до использования. Затем добавьте от 50 до 100 микромолярного белка FoxP1 к десятикратному молярному избытку DTT или TCEP и инкубируйте. Поместите обессоливающую колонну PD-10 в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров с помощью адаптера для замены буфера. Добавьте пять миллилитров PBS буфера в колонку для балансировки и центрифугируйте при 1000 г в течение двух минут. Переложите колонку PD-10 в свежую 50-миллилитровую пробирку, и добавьте в колонку два миллилитра буфера PBS. Теперь загрузите в колонку 500 микролитров белка FoxP1. Элюируйте колонку центрифугированием при 1000 г в течение двух минут, чтобы собрать очищенный белок. Перенесите белок в ультрацентробежный фильтр с молекулярной массой 10 килодальтон. После центрифугирования при 7 500 г в течение 10 минут соберите концентрированный элюат. Измерьте концентрацию белка. Затем добавьте BODIPY и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение двух часов на ротаторе. Повторите обмен буфера и концентрацию белка. После определения концентрации белка измерьте степень мечения с помощью формулы. Добавьте 495 микролитров сверхчистой воды и пять микролитров Tween 20 в лунку камерного предметного стекла и хорошо перемешайте. После 30-минутной инкубации при комнатной температуре дважды аккуратно промойте камеру ультрачистой водой и высушите ее. Чтобы сделать поправку на фоновую флуоресценцию, выполните измерения буферного раствора. Калибровка относительной чувствительности параллельных и перпендикулярных детекторов путем получения данных от быстро вращающегося красителя Для экспериментов по одномолекулярной флуоресцентной анизотропии на мономерном FoxP1 добавьте 100 пикомолярных BODIPY меченых FoxP1 и 100 наномолярных немеченых FoxP1 к 500 микролитрам стандартного буфера в предметном стекле камеры. Начните измерения и проверьте в программном обеспечении BIFL, что количество пакетов, записанных в течение 30 секунд, составляет от 60 до 90. Если образец более концентрированный, разбавляйте его до тех пор, пока количество пакетов не попадет в этот диапазон. Наконец, проанализируйте измерения. Анализ времени жизни одномолекулярной флуоресцентной анизотропии выявил одно распределение, происходящее из двух различных времен корреляции вращения в ДНК-связывающем домене FoxP1, что предполагает сосуществование упорядоченных и неупорядоченных структурных ансамблей. Анализ взрывной дисперсии выявил подмножество молекул FoxP1, демонстрирующих высокую анизотропию и избыточные варианты, что предполагает наличие динамических конформационных изменений. Анализ распределения фотонов дифференцировал мономерные и димерные состояния FoxP1, показав различные распределения анизотропии и обменные курсы. Димеризация повлияла на локальные и глобальные движения в FoxP1, при этом измерения избыточной дисперсии указывали на значительные анизотропные изменения в специфических сайтах, меченных цистеином. Анализ динамической анизотропии показал, что FoxP1 подвергается частичному развертыванию при димеризации и связывании ДНК, изменяя долю структурированных и неупорядоченных популяций.