Протокол прямой инъекции блуждающего нерва для крыс

Мы проводим доклинические исследования в области заместительной генной терапии. Мы используем лабораторных животных для создания оптимального метода доставки лекарств для решения проблем вегетативной и периферической нервной системы. Векторная генозаместительная терапия является одной из новых технологий в генной терапии. Применение адиноассоциированного вирусного вектора является одним из потенциальных вариантов, доступных в настоящее время. AAV9 широко используется в исследованиях в области генной терапии для доставки интересующего его гена в центральную и периферическую нервную систему. У исследователей нет достаточных вариантов доставки лекарственных препаратов непосредственно в периферическую нервную систему. Существуют ситуации, связанные с неврологическими расстройствами, вызванными периферической или вегетативной нервной системой. Тем не менее, существует нехватка эффективного метода доставки лекарств для решения этих ситуаций.

Этот метод демонстрирует способ доставки лекарственных препаратов непосредственно в блуждающие нервы для решения проблемы вегетативной нервной системы в доклинических исследованиях на крысах. Кроме того, этот метод может быть экспортирован для доставки лекарств через другие периферические нервы с необходимыми модификациями у других видов. Серая лаборатория продолжит исследования доклинической генной терапии, опосредованные антивирусами, с использованием как грызунов, так и крупных животных. Кроме того, мы были сосредоточены на разработке новых методов, применимых для прокладки стратегии генной заместительной терапии.

[Рассказчик] Для начала подсоедините стеклянный шприц объемом 100 микролитров со снятым поршенем к игле 27 калибра. Подсоедините один конец стерилизованной полиэтиленовой трубки длиной около 45 сантиметров к игле 27 калибра, затем установите трехмиллилитровый пластиковый шприц на иглу 27 калибра и загрузите в шприц примерно 0,5 миллилитра 0,9% обычного физиологического раствора. Используйте 0,9% нормальный физиологический раствор для заполнения полиэтиленовой трубки с открытого конца, обеспечивая полную длину трубки, и цилиндр стеклянного шприца заполняйте до тех пор, пока солевой раствор не переполнится. После этого извлеките и выбросьте трехмиллилитровый шприц и его иглу. Теперь вставьте поршень в цилиндр стеклянного шприца и слегка продвинуте его вперед к середине цилиндра, а стеклянный шприц поместите в насос для шприца. С помощью шприцевого насоса слегка оттяните поршень назад, создав воздушное пространство примерно 1,5 сантиметра на открытом конце трубки. Нанесите пипеткой не менее пяти микролитров красителя и кандидатскую лекарственную смесь с помощью микропипетки объемом 10 микролитров на стерилизованный кусок пара-пленки. С помощью шприцевого насоса извлеките кандидат из лекарственной смеси в трубку, а маркером отметьте уровень инъекционной смеси. Прикрепите иглу 35 калибра к трубке и закрепите ее на чистой поверхности хирургического этапа с помощью ленты, следя за тем, чтобы она оставалась неподвижной, стерилизованной и не касалась ничего другого. Запустите шприцевой насос на 10–15 секунд, пока раствор для инъекций не начнет выходить из кончика иглы. Переложите крысу под наркозом на стол, оборудованный для удаления волос и подготовки участка. Нанесите искусственную слезотечную мазь на оба глаза крысы, чтобы предотвратить чрезмерную сухость. Вводите анальгетики в соответствии с утвержденным протоколом для животных для контроля боли, когда крыса приходит в сознание. Сбривают вентральную сторону шеи в шейном отделе и вытягивают ее примерно на два сантиметра перпендикулярно от средней линии с обеих сторон от подбородка до грудины. Трижды стерилизует выбритый участок 70% этиловым спиртом и 10% бетадином, вытирая наружу по круговой схеме. Перенесите крысу на операционный этап в положении лежа на спине под препарирующим микроскопом. Убедитесь, что грелка под крысой правильно закалена, и отрегулируйте микроскопы так, чтобы они визуализировали шейную область для операции. Зацепите крыс или челюстные зубы нерассасывающимся швом. Зафиксируйте открытый конец шовной нити внутри носового конуса, чтобы ноздри оставались внутри носового конуса на протяжении всей анестезии. Расположите крысу так, чтобы ее голова лежала с левой стороны от хирурга-правши. Подложите под шею стерилизованную марлевую подушку, чтобы выровнять, и расправьте шейный отдел. Накройте тело крысы стерилизованной простыней, оставив открытую операционную область. Закрепите четыре ретракторных штифта с магнитными фиксаторами на четырех углах хирургического этапа. Теперь введите местные анестетики эпидермально по средней линии шейной области, где будет сделан разрез. С помощью лезвия скальпеля сделайте двухсантиметровый продольный разрез кожи по средней линии между подбородком и грудиной в вентральной шейной области. Затем стерилизованными ватными кончиками тупым образом отделяют срезанные края кожицы. С помощью кончиков втягивающего устройства втяните отделенные края кожи в противоположных направлениях. Отделите фасцию с помощью ватных кончиков, чтобы проникнуть глубже, и протолкните слюнные железы в сторону. Теперь отделите грудные сосцевидные мышцы ватными кончиками и втяните их латерально с помощью ретракторных штифтов. Продолжайте разделять ткани с левой стороны трахеи до тех пор, пока не станет видна сонная артерия. С помощью тонких щипцов создайте небольшое отверстие в сонной артерии, не повреждая сонную артерию, и осторожно отделите левый блуждающий нерв от общей сонной артерии. После того, как нерв будет отделен от артерии с помощью щипцов, используйте изогнутую иглу 25-го калибра, прикрепленную к одномиллилитровому шприцу, чтобы зацепить, и удерживайте нерв недоминантной рукой. Удерживайте иглу с заряженной смесью потенциального лекарственного красителя доминирующей рукой. Чтобы облегчить плавный укол, держите нерв прямо, осторожно потянув за него с помощью крючка 25 калибра. Введите иглу в нерв и продвинуте его вперед более чем на 0,5 сантиметра, сохраняя при этом иглу параллельно блуждающему нерву. Слегка потяните назад так, чтобы примерно от 0,4 до 0,5 сантиметра иглы осталось внутри нерва. Ограничьте количество уколов нерва одной иглой не более чем в три раза. После подтверждения введения иглы сохраняйте ее положение, не двигаясь, и включите шприцевой насос. Следите за инфузией, чтобы убедиться, что она остается внутри нерва и течет плавно. С помощью отмеченной точки на инфузионной трубке отслеживайте движение смеси лекарственного красителя. Наблюдайте, как нерв начинает развивать цвет красителя. Извлеките изогнутую иглу 25 калибра и с помощью стерильных ватных наконечников аккуратно верните салфетки в исходное положение. Затем снимите кончики втягивающего устройства. Закройте рану рассасывающимся или нерассасывающимся швом и при необходимости нанесите небольшое количество тканевого клея между швами, чтобы обеспечить идеальное закрытие раны.