Новый и эффективный метод флуоресцентного окрашивания сердца дрозофилы с криосекцией

Моя исследовательская лаборатория использует модель дрозофилы для изучения старения и метаболических нарушений, изучая ограниченное по времени питание и физические упражнения в качестве вмешательства при метаболических заболеваниях, заболеваниях сердечной мышцы, сна и других возрастных заболеваниях. Машинное обучение и омика с физиологической, генетической и пищевой стратегией оптимизируют анализ дрозофил с использованием 3D-печатных устройств и подходов машинного обучения. Флуоресцентная иммуногистохимия сердца дрозофилы позволяет обнаруживать мультибелки в разных генотипах и возрастах, но сталкивается с такими проблемами, как сложные вскрытия, сохранение тканей и визуализация с высоким разрешением определенных паттернов экспрессии белков.

Этот протокол улучшает сохранность тканей, проникновение антител и разрешение визуализации, что позволяет лучше визуализировать маркеры сердечных белков. Он решает такие проблемы, как сложное рассечение, повреждение тканей и ограниченное разрешение при традиционном методе крепления всего сердца. Этот протокол повышает доступность исследований сердца дрозофилы, устраняя сложное вскрытие, позволяя выполнять его одной рукой и избегая дорогостоящей конфокальной микроскопии, что делает визуализацию с высоким разрешением более возможной.

Для начала обезболите от 5 до 10 мух с помощью коврика из углекислого газа. Расположите мух в пределах видимости под микроскопом с увеличением от 1X до 2X. С помощью пружинных ножниц обезглавьте мух, обрежьте крылья, а ноги уберите.

Держите грудную клетку и брюшную полость вместе, что называется телом. С помощью щетки аккуратно поместите тела в помеченные 1,5-миллилитровые пробирки на льду, пока не будут собраны все экспериментальные группы. После извлечения трубок изо льда добавьте в каждую трубку по 100 микролитров 10-миллимоллярной этиленгликольтетрауксусной кислоты при pH 8.

Убедитесь, что все тела погружены в воду, и поместите трубки на орбитальный шейкер на 10 минут. Затем извлеките и выбросьте раствор этиленгликоля тетрауксусной кислоты из пробирок. Внесите пипеткой по 100 микролитров PBS в каждую пробирку, чтобы промыть салфетку в течение 10 минут.

Поместите пробирки на орбитальный шейкер во время процесса промывки. После удаления PBS пипеткой введите в каждую пробирку по 100 микролитров 4%-ного параформальдегида в растворе PBS. Поместите пробирки на орбитальный шейкер при температуре 100 единиц на 15 минут, следя за тем, чтобы ткани оставались в контакте с раствором.

Затем выбросьте раствор параформальдегида. Как только окончательное мытье будет завершено, переложите тела в раствор 10% сахарозы в PBS. Убедитесь, что тела находятся в контакте с раствором внутри трубки.

Достаньте сухой лед из хранилища и выберите несколько штук для помещения в небольшой металлический или пластиковый лоток. Выберите лоток с размерами, позволяющими вставить форму, и поместите его прямо поверх одного большого и плоского куска сухого льда. Заполните форму с этикеткой на 50% оптимальной температурой резки или составом OCT, заливая медленно, чтобы свести к минимуму образование пузырей.

С помощью щетки осторожно поместите рассеченные и зафиксированные тела дрозофилы на поверхность ОКТ-соединения внутри формы. С помощью щипцов прижмите каждое тело к дну формы так, чтобы дорсальная стенка грудной клетки и брюшной полости в целом была выровнена по дну. Отрегулируйте корпуса таким образом, чтобы брюшко лежало ровно вдоль дна формы.

Выровняйте все тела в размерах X, Y и Z, чтобы гарантировать, что каждый раздел будет включать все объекты одновременно. Корректируйте искривление живота, особенно у представителей мужского пола, чтобы максимально сделать его плоским, не прокалывая и не раздавливая тела. Когда все предметы будут на своих местах, расположите форму так, чтобы дно находилось прямо на куске сухого льда.

Убедитесь, что ОКТ-соединение начинает замерзать при контакте, и продолжайте до тех пор, пока все субъекты не будут полностью заключены в форму. После заморозки перенесите форму в морозильную камеру, установленную на температуру минус 20 градусов по Цельсию, чтобы обеспечить полное замораживание по всей длине. После полного замерзания заполните оставшуюся часть формы составом OCT.

Чтобы прикрепить биту патрона к форме, нанесите на блок большое количество компаунда OCT. Прижмите биту к компаунду и дайте ему полностью застыть в криостате, как правило, в течение пяти минут. Затем освободите биту патрона и блок OCT от формы.

Поместите биту в патрон, убедившись, что блок остается правильно ориентированным сверху вниз, и затяните ключ патрона, чтобы зафиксировать биту. Теперь, используя ручки регулировки и регуляторы глубины патрона, совместите блок с лезвием и установите ширину секции 20 микрометров или ниже. Отрежьте каждый кусочек от блока медленным, но последовательным движением, позволяя стеклу с защитой от перекатов захватывать каждый кусочек по мере его разрезания.

Соберите срезы с помощью утепленных горок. Лезвием бритвы удалите излишки ОКТ-соединения, окружающие секции. Очертите границу каждого предметного стекла с помощью гидрофобного маркера, чтобы растворы для стирки и пятен не попадали на ткань.

С помощью пипетки объемом 1000 микролитров трижды промойте предметные стекла PBS по пять минут каждый, не касаясь ткани. После окончательной стирки нанесите пипеткой раствор флуоресцентного красителя на салфетки и выдерживайте в течение часа при комнатной температуре в темноте. Затем выбросьте флуоресцентное пятно и промойте слайды три раза по пять минут каждый с PBS.

После этого выбросьте окончательную смывку PBS, оставив небольшое количество раствора на предметном стекле. С помощью пипетки объемом 1000 микролитров нанесите от трех до пяти капель монтажного материала на предметное стекло, избегая прямого нанесения на ткань. С помощью щипцов расположите чехол на одном краю и постепенно опустите другую сторону, пока она не окажется на одном уровне с предметным стеклом.

Заклейте горки лаком для ногтей без неона и блесток. Если монтажный материал не затвердевает, в зависимости от флуоресцентного пятна, сделайте изображение сразу или отложите слайды на потом. Перед визуализацией осмотрите предметные стекла на чистоту и аккуратно очистите их салфеткой с 70% этанолом в водном растворе.

Проанализируйте наиболее яркие флуоресцентные объекты в рамках эксперимента, чтобы выбрать подходящее время экспозиции для каждого флуоресцентного канала. Опросите каждую экспериментальную группу в режиме реального времени для всех каналов, чтобы подтвердить правильность настроек экспозиции. Для обеспечения согласованности сфокусируйтесь на каждом объекте с помощью одного и того же канала флуоресценции и делайте снимки для всех объектов.

После создания изображения храните слайды в темноте при температуре четыре градуса Цельсия для последующей съемки. Метод флуоресцентной визуализации сохранил ключевые особенности сердца дрозофилы, такие как устье, клапан, продольные волокна и окружные волокна. Вся структура сердечной трубки и детализированные второстепенные структуры были сняты при различном увеличении, с 10-кратным увеличением для всей структуры и от 40-х до 60-кратного увеличения, показывающих более мелкие детали, такие как окружные сократительные волокна и продольные стабилизирующие волокна.

Репрезентативные флуоресцентные микрофотографии продемонстрировали сохранившиеся структуры сердца у дрозофилы w1118 с ядрами, окрашенными DAPI, липидами, окрашенными в зеленый цвет, и актинсодержащими миофибриллами, окрашенными в красный цвет фаллоидином. Окрашивание фаллоидином эффективно выделяло продольные и окружные волокна, демонстрируя сохранение структуры актинового филамента, несмотря на замораживание и рассекающие напряжения. По окрашиванию липидных пятен выявлены жировые отложения, локализованные вблизи сердечной трубки.