Анализ экспрессии онкогенов с изменениями pH в линии протоковых клеток поджелудочной железы
11 апреля 2025 г.
В этом исследовании описан протокол изучения влияния измененного pH на экспрессию онкогена с помощью анализа РНК-секвенирования линии протоковых клеток поджелудочной железы.
В больницах AIG мы исследуем, как снижение секреции протоков поджелудочной железы и снижение pH влияют на экспрессию генов в клетках протоков поджелудочной железы, уделяя особое внимание онкогенам, исследуя возможность клеточной адаптации к кислым микросредам. Проблема здесь заключается в гетерогенности опухолей поджелудочной железы, что усложняет как лечение, так и экспериментальные подходы. Поэтому мы провели анализ РНК протоковых клеток поджелудочной железы в условиях пониженного pH и обнаружили, что существует повышенная экспрессия трех онкогенов, подчеркивающих потенциальные связи между кислой средой и экспрессией онкогенов в протоковых клетках поджелудочной железы.
Наше исследование пролило свет на экспрессию онкогена в условиях пониженного pH, и эта система может продвинуть наши исследования в изучении протоковой аденокарциномы поджелудочной железы в условиях воспаления. Таким образом, будущая цель этого исследования заключается в оценке роли повышенной экспрессии онкогенов в инициации опухолей при воспалительных состояниях, таких как хронический панкреатит. Для начала приобретите нормальную линию протоковых клеток поджелудочной железы человека.
Разморозьте клетки при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане. Теперь процедите свежеприготовленную готовую среду через шприц-фильтр. Добавьте шесть миллилитров готовой среды в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров.
Затем переложите размороженную клеточную суспензию в пробирку и тщательно перемешайте. Центрифугируйте суспензию при 1 800 G в течение шести минут. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте в гранулу один миллилитр питательной среды перед аккуратным перемешиванием.
Далее добавьте в чашку Петри четыре миллиметра 60 миллилитров полной среды. Затем пипеткой каплю клеточной суспензии в колбу. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия при добавлении 5% углекислого газа.
Чтобы изменить рН питательной среды, сначала приготовьте 100 мл 0,5 молярных буферных растворов фосфата натрия со значениями рН 6,0, 6,5 и 7,0. Проверьте pH с помощью рН-метра и отрегулируйте его с помощью одной молярной соляной кислоты или одного молярного гидроксида натрия. Затем процедить, простерилизовать буферы в ламинарном вытяжном шкафу с помощью шприцевого фильтра 0,45 мкм.
Далее в 80 мл питательной среды добавляют 20 мл стерильного 0,5 молярного натрия фосфатного буфера соответствующего рН для приготовления сред с различным рН. Добавьте среду с измененным pH до 85-90% сливающихся протоковых клеток поджелудочной железы человека. Наблюдайте за морфологическими изменениями под светлопольным микроскопом с интервалом в один час в течение шести часов.
Чтобы выделить РНК из культуры, сначала отсадите питательную среду и промойте клетки одним миллилитром PBS. Поставьте 60-миллиметровую тарелку на лед, затем один миллилитр PBS на 60-миллиметровую тарелку и соскребите ячейки скребком для клеток. Теперь переложите суспензию в свежую трубку.
Центрифугируйте его при 8 000 G в течение 10 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Далее добавьте в гранулу 600 микролитров буфера для лизиса, содержащего бета-меркаптоэтанол. Пипетка суспензии вверх и вниз в течение пяти-10 минут на льду.
Добавьте в лизат равный объем 70% этанола и пипеткой в суспензию тщательно перемешайте. Перенесите раствор в колонку с кварцевой мембраной. Затем центрифугируйте колонку при давлении более 8 000 G в течение 30 секунд и отбросьте поток.
Далее добавьте в образец 500 микролитров промывочного буфера и снова центрифугируйте. Центрифугируйте пустую пробирку в течение одной минуты при давлении более 8 000 G. Наконец, добавьте в колонку от 30 до 50 микролитров воды, свободной от нуклеазы. После пятиминутной инкубации при комнатной температуре снова центрифугируйте колонку со скоростью выше 8000 G в течение пяти минут.
Наблюдалось значительное уменьшение размера клеток и усадка пластичных клеток в кислой среде по сравнению с клетками, содержащимися в нормальной среде. Наиболее выраженные изменения в гибели клеток происходили после шести часов инкубации с дальнейшим снижением количества клеток и признаками клеточного стресса через 22 часа. Количество активированных генов было самым высоким при pH 6,5 со 148 генами, за ним следовали pH 7 с 109 генами и pH 6 с 90 генами.
Пониженных генов было меньше: 20 при pH 6, 14 при pH 6,5 и 23 при pH 7. Три онкогена, LCK, FGR и ASAP 3, были повышены по всем исследуемым уровням pH, что указывает на их роль в пролиферации клеток в кислых условиях.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании с помощью анализа RNA-seq изучается влияние снижения pH на экспрессию онкогенов в клетках протоков поджелудочной железы. Полученные результаты указывают на связь между кислой средой и повышенной экспрессией онкогенов, что может быть полезно для дальнейших исследований протоковой аденокарциномы поджелудочной железы.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Онкология
- Клеточная биология
- Экспрессия генов
Теоретическая часть
- Секреция протоков поджелудочной железы может снижаться, что приводит к изменению уровня pH.
- Кислая микросреда может влиять на экспрессию генов в клетках протоков поджелудочной железы.
- Гетерогенность опухолей поджелудочной железы осложняет лечение и исследования.
- Понимание экспрессии онкогенов в этих условиях имеет решающее значение для исследований рака.
Цель исследования
- Изучить влияние снижения pH на экспрессию онкогенов в клетках протоков поджелудочной железы.
- Исследовать механизмы клеточной адаптации к кислой среде.
- Получить данные о роли онкогенов при раке поджелудочной железы в условиях воспаления.
Используемые методы
- RNA-seq анализ клеток протоков поджелудочной железы.
- Сравнение экспрессии генов при нормальном и пониженном значениях pH.
- Анализ изменений экспрессии онкогенов.
- Оценка потенциальной связи между кислой средой и активностью онкогенов.
Основные результаты
- При пониженных значениях pH наблюдалось повышение экспрессии трех онкогенов.
- Полученные данные указывают на потенциальную связь между кислой средой и экспрессией онкогенов.
- Исследование подчеркивает важность pH в биологии клеток протоков поджелудочной железы.
- Результаты могут способствовать более глубокому пониманию протоковой аденокарциномы поджелудочной железы.
Выводы
- Изменение pH оказывает значительное влияние на экспрессию онкогенов в клетках протоков поджелудочной железы.
- В будущих исследованиях следует оценить роль онкогенов в инициировании опухоли при воспалительных состояниях.
- Данное исследование закладывает основу для дальнейшего изучения механизмов развития рака поджелудочной железы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Понимание того, как кислые микроокружения стимулируют экспрессию онкогенов в клетках протоков поджелудочной железы, позволяет решить критически важную задачу в биологии рака на ранних стадиях и валидации мишеней. Данный рабочий процесс на основе RNA-seq обеспечивает механистическое снижение рисков путем установления связи между стрессорами окружающей среды и активацией генов, что служит основой для создания прогностических моделей инициации опухоли в условиях воспаления. Этот подход помогает при принятии решений по формированию портфеля препаратов за счет уточнения биологических рисков в системах, релевантных для данного заболевания.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать активацию онкогенов в физиологически значимых условиях закисления.
- Способствует снижению механистических рисков путем сопоставления изменений экспрессии генов с воздействием факторов внешней среды.
- Разъясняет роль pH микроокружения в функциональной валидации мишеней при раке поджелудочной железы.
- Повышает прогностическую уверенность при отборе приоритетных проектов на ранних стадиях в онкологических программах.
Скрининг и разработка анализа
- Создает валидированную клеточную систему для оценки экспрессии генов в контролируемых условиях pH.
- Обеспечивает воспроизводимость рабочих процессов RNA-seq для количественной оценки дифференциальной экспрессии генов.
- Позволяет стандартизировать условия анализа для последующего скрининга соединений в кислых микросредах.
- Предоставляет количественные данные для оценки готовности анализа и масштабируемости платформы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит данные, полученные in vitro, в соответствие с факторами микроокружения, характерными для хронического панкреатита и PDAC.
- Обеспечивает трансляционную преемственность путем моделирования триггеров инициации опухоли в доклинических системах.
- Позволяет принимать обоснованные решения о продвижении исследований с учетом рисков на основе механистического понимания активации онкогенов.
- Повышает прогностическую значимость при поиске биомаркеров опухолеобразования, вызванного воспалением.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный рабочий процесс RNA-seq позиционирует модуляцию кислого pH как инструмент этапа поиска для установления связи между воздействием стресса окружающей среды и активацией онкогенов, объединяя раннюю проверку гипотез с разработкой доклинических моделей.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о влиянии кислотного стресса на экспрессию генов и риск инициации опухоли.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимую количественную платформу для оценки изменений экспрессии генов при различных значениях pH.
- Аналитика: позволяет получить данные о дифференциальной экспрессии генов для сравнения активации онкогенов в определенных условиях.
- Трансляционные исследования: моделирует релевантные заболеванию микроокружения для разработки стратегий доклинической валидации.
- Применение в масштабах предприятия: предлагает масштабируемый рабочий процесс, адаптируемый к другим клеточным линиям и переменным окружающей среды в онкологических исследованиях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней путем установления связи между факторами окружающей среды и экспрессией онкогенов.
- Операционная ценность: Стандартизирует протоколы RNA-seq и культивирования клеток для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), уточняя механистические риски на ранних стадиях онкологических программ.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней и моделей с учетом рисков на основе их чувствительности к факторам окружающей среды.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, модуляцией pH и анализом данных RNA-seq.
- Необходим доступ к платформам секвенирования следующего поколения и биоинформатическим инструментам для анализа дифференциальной экспрессии.
- Требуется строгая стандартизация протоколов регулирования pH и обработки образцов между исследовательскими группами.
- Адаптация метода для других типов клеток или моделей заболеваний может потребовать оптимизации параметров окружающей среды.
- При интерпретации изменений экспрессии генов необходимо учитывать жизнеспособность клеток и ограничения, связанные со стрессовым ответом.
