Выделение и культивирование первичных мышиных адипоцитов у худых мышей и мышей с ожирением

Наши исследования сосредоточены на изучении функции зрелых адипоцитов из различных жировых депо и диетических условий. Мы особенно заинтересованы в понимании того, как зрелые адипоциты взаимодействуют с окружающими клетками и как эти перекрестные помехи могут влиять на прогрессирование заболевания и изменяться при ожирении. Зрелые адипоциты являются крупными и нежными клетками, что делает широко используемые методы выделения клеток, такие как FACS, неэффективными.

Кроме того, высокий уровень свободных липидов, часто встречающийся в жировой ткани, может быть токсичным для зрелых адипоцитов, осложняя их поддержание. В отличие от широко используемых методов, которые основаны на дифференцировке преадипоцитов in vitro, этот протокол позволяет нам изучать изолированные адипоциты ex vivo, которые функционально и транскрипционно похожи на адипоциты in vivo. Это особенно важно, так как адипоциты сильно варьируются между жировыми депо и в разных условиях питания.

Этот протокол эффективно изолирует, отражая зрелые адипоциты, и легко масштабируется. Включены корректировки для оптимизации выделения адипоцитов от мышей разного пола и с различными условиями питания. После выделения адипоциты могут быть культивированы, визуализированы или использованы иным образом по мере необходимости.

Для начала приготовьте раствор коллагеназы с ДНКазой, добавив 0,00017 грамма ДНКазы на один миллилитр раствора коллагеназы, и сделайте смесь вихревой, чтобы обеспечить полное перемешивание. С помощью бритвенного лезвия измельчите выделенную жировую ткань мышей до тех пор, пока она не станет однородной. Затем переложите салфетку фарша в стерильную 50-миллилитровую коническую трубку.

Добавьте приготовленный раствор коллагеназы и ДНКазы в измельченную жировую ткань и вихревите на максимальной скорости в течение семи-10 секунд для тщательного перемешивания компонентов. Затем поместите 50-миллилитровые конические трубки горизонтально в шейкер, установленный на 220 об/мин при 37 градусах Цельсия, на 10 минут. После инкубации извлеките пробирки, похлопайте в течение пяти секунд и проверьте образцы.

Теперь с помощью серологической пипетки пропустите переваренную ткань через сито в новую стерильную 50-миллилитровую коническую трубку. Добавьте FBS, равный объему ткани, и раствор коллагеназы через сито в ту же коническую трубку для нейтрализации коллагеназы. Вращайте трубки при температуре 300 G в течение трех минут при температуре, указанной в приведенной здесь таблице.

Затем с помощью пипетки объемом 200 микролитров аккуратно отбросьте верхний слой свободных липидов. Далее с помощью пипетки Р1000 с отрезанным кончиком перенесите зрелые адипоциты в подготовленную 15-миллилитровую пробирку, содержащую 10 миллилитров питательной среды. Аккуратно переверните 15-миллилитровые пробирки, содержащие зрелые адипоциты, три-пять раз, пока белый слой не рассеется по всей среде.

Дав трубочкам отдохнуть в течение 10 минут, закрутите их при заранее определенной температуре для дальнейшего разделения слоев. После этого с помощью пипетки отбросьте верхний слой свободных липидов. Теперь прикрепите иглу 21 калибра к пятимиллилитровому шприцу и осторожно сдвиньте иглу вниз по краю трубки, пока дно иглы не окажется ниже слоя зрелых адипоцитов.

Затем медленно потяните шприц вверх, чтобы удалить питательную среду и любой клеточный мусор. Аккуратно добавьте в пробирку 10 миллилитров питательной среды. Использование наконечников для пипеток с гелевой нагрузкой Сдвиньте наконечник вниз по краю пробирки, чтобы удалить остатки среды из-под зрелого слоя адипоцитов.

Затем центрифугируйте клетки при 100 G в течение одной минуты. С помощью пипетки удалите свободные липиды. С помощью наконечника пипетки с загрузкой гелем удалите питательную среду ниже адипоцитов.

Извлеките вкладыши для клеточных культур из обработанного тканевой культурой 24-луночного планшета и поместите их мембранной стороной вверх на поверхность колпака. Заполните чередующиеся лунки плиты теплыми питательными средами. С помощью разрезанного наконечника пипетки P200 перенесите 30 микролитров упакованных зрелых адипоцитов на верхнюю часть вкладыша Transwell.

Затем осторожно возьмите вставку Transwell, переверните ее и поместите в предварительно заполненную лунку в 24-луночной пластине. Чтобы удалить среду из лунок, удерживайте вставку Transwell в неподвижном положении и отсасывайте с помощью пипетки P200 через небольшие отверстия по бокам. После удаления среды, все еще удерживая Transwell на месте, медленно добавьте один миллилитр свежей среды вдоль боковой стенки лунки.