Высокопроизводительное измерение клеточного механотипа с помощью проточной цитометрии на основе разрыва и доставки в клетки зондов натяжения ДНК

Наша лаборатория в основном изучает молекулярные механизмы, которые клетки используют для передачи механических стимулов. В последнее время мы разрабатываем высокопроизводительные методы измерения сил, которые клетки оказывают на окружающую среду, чтобы перенести механобиологию в эру омиксов. Исследования показывают, что механические силы влияют на то, как Т-клетки активируются правильным антигеном и как стволовые клетки дифференцируются в специализированные типы клеток.

В последнее время процессы нацеливания на клетки, лежащие в основе нерегулируемой клеточной механики, привели к развитию механотерапиипевтики как способа лечения заболеваний. Дуплексные ДНК-сенсоры и шпильки измеряют внеклеточные силы, в то время как генетически кодируемые сенсоры позволяют проводить внутриклеточные измерения. Почти для всех требуются высококлассные микроскопы.

Микроскопия силы тяги может измерить силу, которую клетки оказывают на окружающую среду, но она также включает в себя визуализацию с высоким разрешением. В этой работе мы решаем три задачи в этой области: во-первых, использование проточной цитометрии для измерения силы вместо визуализации, во-вторых, использование технологии HOH-меток для присоединения лигандов и антител к зондам ДНК, и в-третьих, использование стандартных планшетов для клеточных культур без специальной обработки поверхности. Каким образом изменения сил, генерируемых клетками, могут быть использованы в качестве прогностического маркера состояния заболевания, и способствуют ли эти силы или являются вторичным эффектом указанного состояния заболевания?

Для начала соберите дуплексы в соотношении 1,1 к одному моляру анкерной цепи с гасителем и лигандной цепью с флуорофором. Приготовьте дуплексы в конечной концентрации 40 микромолярных нитей лиганда в растворе. Для отжига собранных дуплексов инкубируйте их при температуре 98 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Затем дайте смеси остыть при комнатной температуре в течение одного часа вдали от света. Реакцию отожженных дуплексов с HUH с использованием концентрации наименее распространенной цепи со стадии отжига, которой в данном случае является цепь лиганда. Смешайте дуплексы с HUH в соотношении один к двум молярам в конечной концентрации 10 микромолярного дуплекса и 20 микромолярного HUH.

Инкубируйте реакцию при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут в термоамплификаторе или защищенном от света теплоблоке. После инкубации снимите реакцию с нагрева и используйте настольную мини-центрифугу для вращения теперь собранных тросов манометра натяжения или TGT. Когда ТГТ прилипнут адекватно, трижды промойте лунки с нужными клетками PBS.

После этого проведите два мытья с использованием фильтрующего материала без сыворотки и оставьте фильтр в лунках после окончательного мытья. Добавьте 200 микролитров PBS в периферийные лунки для смягчения краевых эффектов. Перенесите тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия, чтобы предварительно прогреть тарелку.

Затем извлеките интересующие клетки с конфлюенсацией примерно на 80%. Аспирируйте среду, затем промойте клетки PBS и инкубируйте клетки с трипсином при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока клетки не диссоциируют, что занимает примерно от пяти до 10 минут. После того, как клетки будут диссоциированы, добавьте первоначальный объем полной клеточной среды, используемой для поддержания клеток.

Ресуспендируйте клетки с помощью серологической пипетки и перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте клетки при 300 G в течение четырех минут. Аспирируйте среду и повторно суспендируйте гранулу в PBS.

После повторения центрифугирования повторно суспендируйте клетки в пяти миллилитрах бессывороточной среды и снова центрифугируйте. Аспирируйте и ресуспендируйте клетки примерно в двух миллилитрах бессывороточной среды. Определите плотность ресуспендированных клеток, чтобы отрегулировать концентрацию по желанию.

При необходимости при проверке эффектов препарата добавьте соответствующую концентрацию препарата в клетки и верните клетки в инкубатор на время до инкубации, прежде чем продолжить. Теперь извлеките исходную пластину из инкубатора и удалите остатки среды, оставшиеся от промывки в экспериментальных лунках. Промойте лунки один раз нужной средой и пипеткой внесите 100 микролитров ресуспендированных клеток в нужные лунки.

Перенесите покрытые клетки в инкубатор на 90 минут. После инкубации удалите примерно от 125 до 170 микролитров объема из каждой лунки. При необходимости аккуратно промойте клетки 200 микролитрами подогретого PBS.

Затем инкубируйте клетки в каждой лунке с 50 микролитрами трипсина, пока клетки не начнут диссоциировать, что занимает примерно от пяти до 10 минут. Далее добавьте в каждую лунку по 160 микролитров свежеприготовленного буфера для потока. Аккуратно проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы диссоциировать клетки.

Переложите 196 микролитров этой клеточной суспензии в ПЦР-пробирки, добавьте четыре микролитра йодида пропидия и аккуратно перемешайте. Наконец, поместите пробирки в ведро со льдом с крышкой, блокирующей любой свет, и измерьте интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитометра. Гейтирование с помощью проточной цитометрии подтвердило успешное выделение живых одиночных клеток, обеспечив точный анализ механотипа.

Отрицательное контрольное стробирование, установленное на 99-м процентиле флуоресценции Cy5-A, послужило основой для сравнения экспериментальных условий. Клетки CHO-K1, обработанные Y27632, показали значительное снижение процента клеток, превышающих отрицательный контрольный затвор при сдвиге TGT, в то время как расстегивание TGT показало лишь скромное и статистически незначимое снижение. Расстегивание ТГТ неизменно приводило к более высокому проценту клеток, превышающих отрицательный контроль, по сравнению со сдвиговыми ТГТ, что подтверждает их более низкую потребность в силе.