Выделение и идентификация штаммов бактерий из кожи наземных амфибий

Данное исследование было направлено на разработку эффективного протокола сбора микробиоты кожи диких наземных амфибий и обеспечение микробной целостности при хранении и обращении.

К числу основных проблем относятся предотвращение загрязнения проб, поддержание жизнеспособности микроорганизмов во время хранения и культивирование медленного роста для полной оценки разнообразия микробиоты кожи амфибий.

Установлено, что солевой раствор, усиленный глицерином, сохраняет целостность микробиоты кожи амфибий при хранении и обращении, последовательном культивировании бактерий и совершенствовании стратегий сохранения микроорганизмов для экологических и биотехнологических исследований.

Этот протокол решает проблему отсутствия стандартизированных методов отбора проб, сохраняет и обрабатывает культивируемые бактерии кожи амфибий, а также обеспечивает целостность сообщества.

[Рассказчик] Для начала простерилизуйте среду путем автоклавирования при температуре от 121 до 134 градусов Цельсия в течение 15–30 минут. После автоклавирования дайте агаровой среде остыть примерно до 45-50 градусов Цельсия. Под предварительно простерилизованный ламинарный вытяжной колпак перелейте остывшую среду в стерильные чашки Петри. Как только агар застынет, пометьте чашки Петри средним типом и датой приготовления. Смешайте полученный в полевых условиях образец с раствором, прижав тампон к стенкам пробирки, сжимая пробирку и тщательно вращая тампон 10 раз по часовой стрелке и 10 раз против часовой стрелки. Перед обработкой тщательно перемешайте микробиологический образец. Готовят серийное разведение кожного образца солевым раствором в диапазоне от 10 в степени от -1 до 10 в степени -6. Инокулировать 100 микролитров неразбавленного образца и серийное разведение на подготовленные агаровые пластины. С помощью стерильной L-образной петли распределите образец по поверхности агаровой среды, обеспечивая равномерное распределение без чрезмерного давления. Переверните инокулированные планшеты и поместите их в инкубатор, установленный при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия, на три-пять дней, чтобы поддержать рост мезофильных и психотропных бактерий на коже амфибий. После инкубации выберите колонии бактерий с различной морфологией для дальнейшего анализа. Убедитесь, что колонии хорошо изолированы и демонстрируют различные внешние проявления, такие как вариации цвета, размера, формы, края, поверхности или текстуры. Чтобы субкультивировать выбранные колонии, хорошо изолированную колонию пересадите с исходной агаровой пластины на свежую агаровую пластину с помощью инокуляционного контура в асептических условиях. Проведите полосы по колонии, чтобы изолировать ее. А затем правильно его инкубировать. Здесь показана скоординированная процедура отбора проб особи speleomantes italicus с использованием стерильных инструментов в полевых условиях. Отбор проб выполнялся двумя операторами с использованием стерильных перчаток и тампонов, чтобы свести к минимуму нагрузку на амфибию и обеспечить точность при обращении. Тампон был немедленно перенесен в физиологический раствор с 20% глицерина для сохранения микробной целостности во время транспортировки в лабораторию. Здесь приведено сравнение плотности микробного сообщества, содержащегося в солевом растворе с добавлением глицерина и без него. Бактериальная нагрузка при хранении в физодном растворе без глицерина была достоверно ниже, чем в контроле и при использовании физиологического раствора с глицерином. Микробное сообщество, хранящееся в физиологическом растворе с глицерином, показало аналогичную контрольной бактериальной нагрузке, что указывает на сохранение микробной целостности. Наилучшая сохранность микробного сообщества наблюдалась в физиологическом растворе с глицерином, хранящимся при температуре четыре градуса Цельсия, демонстрируя наиболее стабильную бактериальную нагрузку с течением времени. Хранение только в физрастворе при комнатной температуре приводило к наибольшему росту бактерий, что указывает на микробное загрязнение или селективное продвижение определенных бактериальных групп. Замораживание до минус 20 градусов по Цельсию снижало бактериальную нагрузку, что позволяет предположить, что низкие температуры негативно влияют на выживание микробов.