Однонуклеотидный полиморфизм-чувствительный FISH детектирование локус-специфичной транскрипции рибосомальной РНК у Drosophila melanogaster

Наши исследования сосредоточены на понимании того, как клетки воспринимают, контролируют и регулируют множественные локусы рибосомной ДНК в своем геноме. В частности, мы стремимся раскрыть механизмы, которые различают, какие локусы рДНК активно транскрибируются и как эти локусы регулируются индивидуально. Недавно мы обнаружили, что количество рДНК в клетке может меняться с течением времени, и что это изменение изменяет то, какие локусы рДНК транскрибируются.

Теперь мы понимаем, что клетки будут изменять свою транскрипцию рДНК в зависимости от количества рДНК, которое у них есть. Это открытие приводит нас к вопросу о том, откуда клетки узнают, сколько RDA у них есть и как они определяют, какой локус рДНК они предпочтут экспрессировать. В настоящее время наша лаборатория сосредоточена на понимании механизма, который клетки используют для различения различных локусов рДНК и ощущения и регулирования их активности.

Под стереомикроскопом препарируйте дрозофилу для выделения яичек в PBS, свободных от РНКазы. Для начала возьмитесь за середину живота одной парой щипцов и за конец живота другой парой, чтобы аккуратно раздвинуть животное. С помощью щипцов перенесите изолированные яички из препарирующей чашки в 1,5-миллилитровую микропробирку, содержащую 0,5 миллилитров PBS, не содержащей РНКазы.

Аспирируйте PBS и добавьте один миллилитр фиксирующего раствора. Поместите образец на шейкер для орехов при комнатной температуре на 30 минут. После инкубации аспирируйте фиксирующий раствор.

Затем промойте образец два раза одним миллилитром PBS в течение пяти минут каждый на шейкере. После аспирации PBS добавьте один миллилитр 70% этанола без РНКазы и инкубируйте образец при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи в шейкере. Далее отсадите этанол и добавьте в образец один миллилитр промывочного буфера.

Инкубируйте образец при комнатной температуре в ореховом шейкере в течение трех минут. После этого дайте трубке отдохнуть в вертикальном положении в течение двух минут. Смешайте зонды и маски с буфером для гибридизации, чтобы получить общий объем 100 микролитров на образец, как показано здесь.

Затем добавьте в образец 100 микролитров гибридизационного раствора после отсасывания промывочного буфера. Наклейте прозрачную пленку, чтобы заклеить края трубки. Оберните пробирку алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от света, и выдержите образец на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия не менее 24 часов.

Не отсасывая гибридизационный раствор, добавьте в образец один миллилитр промывочного буфера. Инкубируйте образец на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут в темноте. После того, как промывочный буфер будет отсажен, добавьте один миллилитр свежего промывочного буфера в образец и снова инкубируйте.

По окончании инкубации отсадите промывочный буфер и добавьте в образец 50 микролитров монтажной среды. Под препарирующим стереомикроскопом с помощью пипетки перенесите образец на предметное стекло микроскопа. С помощью щипцов расположите яички на предметном стекле микроскопа в одну линию, чтобы облегчить идентификацию образца во время визуализации.

Накройте образец защитным стеклом и промокните края защитного стекла салфеткой, чтобы удалить излишки монтажного материала. Заклейте края чехла лаком для ногтей и оставьте их в темноте при комнатной температуре на 10 минут, чтобы лак для ногтей высох. Сигналы рРНК были обнаружены в ядрышке, проявляясь в виде поровых областей DAPI внутри ядра, особенно в половых клетках с большими ядрами и ядрышками.

Слабые, неспецифические сигналы наблюдались в цитоплазме в образцах, лишенных локусов рРНК. В большинстве клеток были обнаружены исключительно сигналы YrRNA, указывающие на транскрипцию рРНК из локуса YrDNA. В половых клетках наблюдалась совместная экспрессия X и YrRNA, при этом сигналы либо сливались в одно ядро, либо разделялись на два ядрышка.