Однонуклеотидный полиморфизм-чувствительный FISH детектирование локус-специфичной транскрипции рибосомальной РНК у Drosophila melanogaster
28 марта 2025 г.
В протоколе описан метод флуоресцентной гибридизации in situ (SNP-FISH), чувствительный к однонуклеотидным полиморфизмам, для различения транскриптов рибосомной РНК, полученных из локуса рибосомальной ДНК X или Y хромосомы у Drosophila melanogaster.
Наши исследования сосредоточены на понимании того, как клетки воспринимают, контролируют и регулируют множественные локусы рибосомной ДНК в своем геноме. В частности, мы стремимся раскрыть механизмы, которые различают, какие локусы рДНК активно транскрибируются и как эти локусы регулируются индивидуально. Недавно мы обнаружили, что количество рДНК в клетке может меняться с течением времени, и что это изменение изменяет то, какие локусы рДНК транскрибируются.
Теперь мы понимаем, что клетки будут изменять свою транскрипцию рДНК в зависимости от количества рДНК, которое у них есть. Это открытие приводит нас к вопросу о том, откуда клетки узнают, сколько RDA у них есть и как они определяют, какой локус рДНК они предпочтут экспрессировать. В настоящее время наша лаборатория сосредоточена на понимании механизма, который клетки используют для различения различных локусов рДНК и ощущения и регулирования их активности.
Под стереомикроскопом препарируйте дрозофилу для выделения яичек в PBS, свободных от РНКазы. Для начала возьмитесь за середину живота одной парой щипцов и за конец живота другой парой, чтобы аккуратно раздвинуть животное. С помощью щипцов перенесите изолированные яички из препарирующей чашки в 1,5-миллилитровую микропробирку, содержащую 0,5 миллилитров PBS, не содержащей РНКазы.
Аспирируйте PBS и добавьте один миллилитр фиксирующего раствора. Поместите образец на шейкер для орехов при комнатной температуре на 30 минут. После инкубации аспирируйте фиксирующий раствор.
Затем промойте образец два раза одним миллилитром PBS в течение пяти минут каждый на шейкере. После аспирации PBS добавьте один миллилитр 70% этанола без РНКазы и инкубируйте образец при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи в шейкере. Далее отсадите этанол и добавьте в образец один миллилитр промывочного буфера.
Инкубируйте образец при комнатной температуре в ореховом шейкере в течение трех минут. После этого дайте трубке отдохнуть в вертикальном положении в течение двух минут. Смешайте зонды и маски с буфером для гибридизации, чтобы получить общий объем 100 микролитров на образец, как показано здесь.
Затем добавьте в образец 100 микролитров гибридизационного раствора после отсасывания промывочного буфера. Наклейте прозрачную пленку, чтобы заклеить края трубки. Оберните пробирку алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от света, и выдержите образец на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия не менее 24 часов.
Не отсасывая гибридизационный раствор, добавьте в образец один миллилитр промывочного буфера. Инкубируйте образец на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут в темноте. После того, как промывочный буфер будет отсажен, добавьте один миллилитр свежего промывочного буфера в образец и снова инкубируйте.
По окончании инкубации отсадите промывочный буфер и добавьте в образец 50 микролитров монтажной среды. Под препарирующим стереомикроскопом с помощью пипетки перенесите образец на предметное стекло микроскопа. С помощью щипцов расположите яички на предметном стекле микроскопа в одну линию, чтобы облегчить идентификацию образца во время визуализации.
Накройте образец защитным стеклом и промокните края защитного стекла салфеткой, чтобы удалить излишки монтажного материала. Заклейте края чехла лаком для ногтей и оставьте их в темноте при комнатной температуре на 10 минут, чтобы лак для ногтей высох. Сигналы рРНК были обнаружены в ядрышке, проявляясь в виде поровых областей DAPI внутри ядра, особенно в половых клетках с большими ядрами и ядрышками.
Слабые, неспецифические сигналы наблюдались в цитоплазме в образцах, лишенных локусов рРНК. В большинстве клеток были обнаружены исключительно сигналы YrRNA, указывающие на транскрипцию рРНК из локуса YrDNA. В половых клетках наблюдалась совместная экспрессия X и YrRNA, при этом сигналы либо сливались в одно ядро, либо разделялись на два ядрышка.
Обзор
В данном исследовании представлен протокол флуоресцентной гибридизации in situ, чувствительной к однонуклеотидным полиморфизмам (SNP-FISH), предназначенный для дифференциации транскриптов рибосомной РНК из локусов рибосомной ДНК X- и Y-хромосом у Drosophila melanogaster. Целью исследования является выяснение механизмов, с помощью которых клетки регулируют транскрипцию различных локусов рибосомной ДНК.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Генетика
- Клеточная биология
Теоретическая часть
- Клетки отслеживают и регулируют локусы рибосомальной ДНК в своем геноме.
- Понимание транскрипционной регуляции локусов рДНК имеет решающее значение.
- Недавние данные свидетельствуют о том, что количество рДНК может изменяться с течением времени.
- Клетки адаптируют транскрипцию рДНК в зависимости от имеющегося количества рДНК.
Цель исследования
- Изучить, как клетки различают различные локусы рДНК.
- Понять регуляцию транскрипции рДНК в ответ на изменение клеточных условий.
- Исследовать механизмы предпочтения локусов рДНК в процессе транскрипции.
Используемые методы
- Диссекция Drosophila для выделения семенников.
- Использование PBS, свободного от РНаз, для подготовки образцов.
- Применение растворов для фиксации и гибридизации.
- Детекция сигналов рРНК с помощью флуоресцентной микроскопии.
Основные результаты
- Сигналы рРНК были обнаружены в ядрышках зародышевых клеток.
- В некоторых клетках наблюдалась коэкспрессия X и YrRNA.
- Были отмечены отчетливые паттерны транскрипции в зависимости от локуса рДНК.
- Слабые сигналы были обнаружены в образцах, лишенных локусов рРНК.
Выводы
- Метод SNP-FISH эффективно позволяет различать транскрипты рРНК.
- Клетки демонстрируют селективную транскрипцию в зависимости от активности локуса рДНК.
- Данное исследование углубляет понимание регуляции рДНК у Drosophila.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Дифференциация транскрипции рибосомной РНК на уровне конкретных локусов имеет решающее значение для понимания клеточной адаптации и биогенеза рибосом в системах, имеющих значение для патологии. Метод FISH с чувствительностью к SNP позволяет напрямую визуализировать транскрипционную активность рРНК из различных геномных локусов, что способствует механистическому снижению рисков и валидации мишеней на ранних этапах поиска. Эта возможность повышает прогностическую уверенность при проведении трансляционных исследований и приоритизации портфеля проектов в условиях сложных генетических фонов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать локус-специфическую транскрипционную регуляцию рРНК в отдельных клетках.
- Обеспечивает функциональную валидацию регуляторных механизмов, контролирующих биогенез рибосом.
- Способствует механистическому снижению рисков путем разграничения транскрипционных источников в гетерогенных системах.
- Повышает прогностическую достоверность при приоритизации генетических мишеней, влияющих на функцию рибосом.
Скрининг и разработка анализа
- Предлагает валидированный метод количественного определения выхода рРНК в конкретных локусах для различных типов клеток.
- Позволяет стандартизировать показатели транскрипционной активности рРНК в различных экспериментальных условиях.
- Обеспечивает воспроизводимое обнаружение сдвигов транскрипции в ответ на генетические или средовые воздействия.
- Подготавливает биологические системы для последующего скрининга модуляторов, влияющих на активность локусов рДНК.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям релевантных заболеваний, в которых задействован рибосомальный стресс или переключение локуса.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет отслеживания локус-специфических транскрипционных изменений.
- Поддерживает принятие обоснованных решений по дальнейшему продвижению с учетом рисков, предоставляя количественные данные о транскрипции с разрешением по локусам.
- Способствует разработке биомаркеров рибосомальной дисфункции в трансляционных исследованиях.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Метод SNP-FISH интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая возможность локус-специфического анализа транскрипции, что способствует как проверке гипотез, так и разработке количественных методов анализа.
- Открывающая биология: предоставляет прямые доказательства локус-специфической транскрипционной регуляции и позволяет уточнить механизмы путей передачи сигнала.
- Скрининг: обеспечивает количественные, воспроизводимые показатели транскрипции рРНК из отдельных локусов.
- Аналитика: позволяет проводить статистическое сравнение транскрипционной активности между локусами рДНК при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает локус-специфические изменения транскрипции с моделями заболеваний и стратегиями поиска биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: предлагает широко адаптируемую платформу для анализа транскрипции с разрешением по локусам в различных системах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и устраняет механистическую неопределенность в биологии рибосом.
- Операционная ценность: стандартизирует локус-специфические анализы транскрипции для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: помогает принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) за счет уточнения регуляторных механизмов и источников транскрипции.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации мишеней и моделей с учетом рисков на основе локус-специфических транскрипционных фенотипов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами флуоресцентной гибридизации in situ и анализом единичных клеток.
- Необходим доступ к современному оборудованию для флуоресцентной микроскопии и инфраструктуре анализа изображений.
- Требуется строгая стандартизация дизайна зондов и протоколов гибридизации между исследовательскими группами.
- Адаптация к другим модельным системам может потребовать оптимизации зондов для конкретных локусов.
- Интерпретация результатов ограничена системами с различимыми вариантами последовательностей рРНК.
