Изучение индуцированной наночастицами меди запрограммированной гибели клеток у бактерий

В этом исследовании изучается нанопартикальная бактерицидная эффективность меди против трех распространенных клинически значимых бактерий. В нем исследуются случаи, включая генерацию АФК и потенциальное участие в запрограммированной гибели клеток.

Одной из текущих проблем является достижение стабильного подсчета колоний. Я считаю, что это связано с вмешательством. Модернизация клеток при разведении стеблей подделывает подсчет с локацией по сравнению с более опытным подсчетом.

Наша группа была первой, кто использовал клеточный модулятор для изучения бактерицидных механизмов наночастиц меди, обнаружив, что бактериальная смерть связана с клеточными процессами, такими как генерация АФК и аутофагия.

Протокол направлен на более глубокое понимание механизма, с помощью которого наночастицы меди убивают бактерии, уделяя особое внимание малоизученной области запрограммированных путей гибели бактериальных клеток.

Используя различные клеточные модуляторы, мы подтвердили, что индуцированная наночастицами меди бактериальная смерть включает аутофагию и перегрузку АФК, и определили ключевые пути, поддерживаемые надежными экспериментами на основе трипликатов с простой схемой

[Рассказчик] Для начала получить коммерческие нанопорошки меди диаметром от 25 нанометров и от 60 до 80 нанометров от коммерческого поставщика. Используйте один миллилитр одного миллимолярного SDS в качестве диспергатора для каждого размера наночастиц. Затем диспергируйте наночастицы с помощью ультразвуковой ванны в течение не менее 30 минут при комнатной температуре. Затем получите штаммы Escherichia coli, Acinetobacter baumannii и Staphylococcus aureus из соответствующих биологических ресурсных центров. Культивируйте каждую бактерию в 10 миллилитрах бульона LB в аэробных условиях при температуре 37 градусов Цельсия. Разбавьте бактериальные культуры в среде LB до достижения оптической плотности примерно 0,5 на 600 нанометрах. Теперь используйте исходные растворы наночастиц меди для приготовления диапазона концентраций от нуля до 100 микрограммов на миллилитр обоих размеров. Пипетку 500 микролитров бактериальных культур поместить в микроцентрифужные пробирки и центрифугировать при давлении 3300 г в течение 10 минут при комнатной температуре. После дозирования надосадочной жидкости добавьте в каждую пробирку различные концентрации наночастиц обоих размеров. Обработайте контрольные группы 500 микролитрами PBS в качестве отрицательного контроля и 500 микролитрами 70% алкоголя в качестве положительного контроля. Затем инкубируют все образцы с встряхиванием со скоростью 200 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов. После инкубации промойте бактерии PBS и распределите их на агаровых пластинах LB. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. На следующий день подсчитайте колонии на каждой пластине для всех групп лечения. Обрабатывайте бактерии пятью микромолярными SBI в течение двух часов, 0,5 микромолярного некросульфанида в течение одного часа, 100 наномолярным вортманнином в течение 30 минут или 100 наномолярными Z-VAD в течение 30 минут. После завершения предварительной обработки центрифугируйте все пробирки при давлении 3 300 G в течение 10 минут. Затем повторно суспендируйте гранулу в 800 микролитрах PBS для промывки модулятора предварительной обработки. Распределите ресуспендированные гранулы. Центрифугируйте каждую пробирку, затем выбросьте надосадочную жидкость. Суспендируйте гранулы в смесях модуляторов наночастиц перед инкубацией с перемешиванием. Теперь добавьте 70% этанола и PBS в качестве положительного и отрицательного контроля. Включайте холостые контрольные группы, обработанные ингибиторами, но не наночастицами. После инкубации пипетку с реагентом жизнеспособности клеток в соотношении один к десяти объему и инкубируйте. После повторного центрифугирования культур перенесите надосадочную жидкость в 96-луночные планшеты. Измеряйте флуоресценцию при возбуждении 560 нанометров и излучении 590 нанометров с помощью считывателя микропланшетов. Оставшиеся надосадочные пласты разбавляют до 10 в степени минус 5 и 10 в степени минус 4 и распределяют на ЛБ агаровых пластинах к культуре. Посчитайте отдельные колонии на следующий день. Пипетка бактериальных культур в микроцентрифужные пробирки. Затем подвергайте культуры воздействию ультрафиолетового света 405 нанометров в течение трех часов. Далее инкубируйте культуры при температуре 45 градусов Цельсия в течение двух часов. Затем инкубируйте бактерии при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух часов. После обработки холодом инкубируйте бактерии в 3% перекиси водорода в течение 30 минут. Поддерживайте контрольную группу при температуре 37 градусов Цельсия в бульоне LB. Теперь обрабатывайте бактерии частицами размером 20 или 60 нанометров в концентрации от одного до 100 микрограммов на миллилитр в течение 24 часов. Затем дважды промойте обработанные бактерии PBS. После центрифугирования ресуспендируйте бактериальные гранулы в пятимикромолярном растворе 2',7' дихлордигидрофлуоресцеина диацетата красителя. Проанализируйте интенсивность флуоресценции при излучении 520 или 530 нанометров. Количество колоний Escherichia coli было значительно снижено на 20 нанометров наночастиц меди в дозе один микрограмм на миллилитр и на 60 нанометров в дозе 5 микрограммов на миллилитр. Золотистый стафилококк показал значительное снижение количества колоний при всех концентрациях обоих размеров наночастиц. У Acinetobacter baumannii для уменьшения численности колонии требовалось пять микрограммов на миллилитр 20-нанометровых наночастиц меди и 10 микрограммов на миллилитр 60-нанометровых наночастиц меди. Обработка наночастицами меди индуцировала выработку активных форм кислорода у всех бактерий, при этом частицы размером 20 нанометров демонстрируют самые высокие доли положительных клеток при более низких концентрациях. Напротив, обработка наночастицами меди с помощью 60 нанометров привела к последовательному образованию активных форм кислорода при всех концентрациях. Программируемый модулятор клеточной смерти Z-VAD увеличивал выживаемость кишечной палочки, обработанной наночастицами обоих размеров в низких и умеренных концентрациях. Лечение NSA улучшило выживаемость золотистого стафилококка при всех 20-нанометровых концентрациях наночастиц меди. Acinetobacter baumannii продемонстрировал улучшенную жизнеспособность с Z-VAD при одном, пяти и 10 микрограммах на миллилитр при воздействии медных частиц как 20, так и 60 нанометров, в то время как NSA увеличивал жизнеспособность всего на 10 микрограммов на миллилитр при 20-нанометровом воздействии наночастиц меди.