Быстрая изоляция внеклеточных везикул, полученных из грудного молока человека

Наша работа сосредоточена на понимании вклада экзосом, полученных из грудного молока, в регуляции воспаления. Текущие экспериментальные задачи — это просто время, необходимое для выделения этих внеклеточных пузырьков. Так что, надеюсь, мы хотим сократить это необходимое время.

Преимущество нашего протокола перед другими методами заключается в значительном сокращении времени, необходимое для выделения этих внеклеточных пузырей из грудного молока человека, по сравнению с другими методами. Внеклеточные везикулы в последнее время привлекают внимание как потенциальные терапевтические цели. Поэтому, если мы значительно сократим время, необходимое для выделения этих внеклеточных везикулов, мы потенциально сможем использовать их в клинических условиях.

Для начала положите грудное молоко в шкаф с биобезопасностью и разведите его в соотношении один к десяти с помощью стерильного PBS. Аккуратно перемешайте раствор, чтобы обеспечить равномерное разбавление. Центрифугуйте разбавленное грудное молоко при 300 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.

После центрифугирования наблюдайте три чётко выраженных слоя в трубке. Молочный жир сверху, обезжиренное молоко или сыворотка посередине, а внизу — гранула клеток и мусора. В шкафе с биобезопасностью фильтруйте слои молочного жира и сыворотки через фильтр диаметром 0,7 микрометра, не трогая гранулу.

Перенесите поток в новую трубку. Затем центрифугуйте отфильтрованный образец при 2 600 G в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. В биобезопасном шкафе фильтруйте полученный супернатант через фильтр диаметром 0,7 микрометра и переносите конечный супернатант в трубку объемом 15 миллилитров.

В шкафе для биобезопасности используйте удлинитель фильтра диаметром 0,22 микрометра 16 дюймов с 5,4 миллилитра PBS. С помощью шприца промите систему PBS, пока жидкость не выйдет из противоположного конца трубки. Фильтруйте грудное молоко шприцом через удлинитель 16-дюймового фильтра диаметром 0,22 микрометра для удаления оставшегося молочного жира, клеток и мусора.

Наконец, соберите фильтрованный поток в 15-миллилитровую коническую трубку. Внеклеточные везикулы, полученные методом быстрой фильтрации, сравнивались с теми, что получены ультрацентрифугированием. Анализ отслеживания NanoSight показал, что внеклеточные везикулы, выделенные с помощью ультрацентрифугации, имели средний размер примерно 100 нанометров, при этом концентрация частиц достигала пика в этом диапазоне.

Быстрая фильтрация также дала внеклеточные везикулы с примерно 100 нанометров, но концентрация частиц была заметно выше, чем при ультрацентрифугировании. Вестерн-блот показал, что тепловой шоковый белок 70 сравнительно экспрессируется в внеклеточных везикулах, выделенных как ультрацентрифугированием, так и быстрой фильтрацией. CD9 и CD63 были обнаружены в внеклеточных везикулах, выделенных как ультрацентрифугированием, так и быстрой фильтрацией.

Трансмиссионная электронная микроскопия при увеличении 8 000 раз показала везикулы с типичной морфологией в ультрацентрифугированных изолированных образцах и схожей формы везикулы в тех, что получены методом быстрой фильтрации. Воздействие перекиси водорода значительно снижало жизнеспособность клеток и их количество в культурах IEC-6, что подтверждало цитотоксические эффекты. Совместное лечение с внеклеточными везикулами, выделенными ультрацентрифугой или быстрой фильтрацией, значительно восстановило жизнеспособность клеток и их численность, демонстрируя сопоставимые защитные эффекты.