Быстрое истощение почечных макрофагов с помощью инструмента для абляции клеток CD59/интермедилизина человека

Мы используем интермедилизин-опосредованное подношение человеческой CD59-экспрессирующей клетки у мышей для изучения регенерации почечных микрофагов, уделяя особое внимание хемокиновому восстановлению моноцитов и созданию ниши иммунного надзора после травмы. Последние разработки в нашей области раскрывают механизм регенерации почечных макрофагов, выделяя специфические хемокины, которые рекрутируют макрофаги, и то, как восстанавливается иммунный надзор после острого повреждения почек. Мы сочетаем криогенетику, индуцируемую тамоксифеном, абляцию интермедилизина, многопараметрическую проточную цитометрию и прижизненную микроскопию для абляции, отслеживания и визуализации макрофагов почек в режиме реального времени.

Основными проблемами являются предотвращение системного воспаления, нацеливание только на резидентные макрофаги и измерение быстрой регенерации без нарушения чувствительной микросреды почек. Мы показали, что моноциты восстанавливают 88% почечных макрофагов в течение семи дней после абляции, что критически зависит от сигнальной оси CX3 CR1, CX3 CL1. Для начала разогрейте кукурузное масло до 42 градусов по Цельсию.

Растворите 100 миллиграмм тамоксифена в пяти миллилитрах подогретого кукурузного масла для приготовления стокового раствора с концентрацией 20 миллиграмм на миллилитр. Вводите тамоксифен внутрибрюшинно мышам в возрасте от 10 до 12 недель в дозе 100 мкг на грамм массы тела. Через 15 дней введите мышам однократную внутривенную дозу интермедилизина в дозе 120 нанограммов на грамм массы тела.

Мониторинг и подтверждение абляции резидентных макрофагов и последующей регенерации путем проведения проточной цитометрии через один, три и семь дней после введения интермедилизина. Для сбора почек с помощью тонких щипцов и ножниц сделайте горизонтальный разрез в нижней части брюшной полости усыпленной мыши. Продлите разрез вертикально по средней линии до чуть ниже грудной клетки или грудины.

Аккуратно втяните кожу и мышцы, чтобы обнажить грудную полость. Разрежьте правое предсердие, чтобы кровь могла оттекать из кровообращения. Введите иглу 21–23 калибра в левый желудочек.

Начните перфузию с 10-20 миллилитров холодной PBS для вымывания крови. Продолжайте перфузию до тех пор, пока почки не станут бледными, что указывает на эффективный клиренс крови. Расположите почки у дорсальной стенки тела и аккуратно отделите их от окружающих тканей с помощью щипцов и ножниц.

Удалите почечные капсулы и немедленно поместите почки в холодный PBS, чтобы предотвратить деградацию. Приготовьте 100 миллилитров ферментного коктейля для пищеварения, смешав HBSS без кальция и магния, коллагеназу IV и DNase I. Приготовьте раствор фермента в свежем виде и держите его на льду до использования. С помощью стерильных ножниц измельчите почки на мельчайшие фрагменты в чашке Петри, содержащей пять миллилитров HBSS.

Переложите измельченную почечную ткань в 15-миллилитровые пробирки, содержащие 10 миллилитров приготовленного ферментного раствора. Теперь инкубируйте трубки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут с легким помешиванием, чтобы диссоциировать ткань. Аккуратно растирайте ткань с помощью пипетки или поршня шприца, чтобы еще больше разбить клеточные комки.

Удалите мусор, пропустив клеточную суспензию через клеточный фильтр с плотностью 40 микрометров. Центрифугируйте клеточную суспензию при 700 G в течение 10 минут при 18 градусах Цельсия. Далее тщательно сцеживаем буфер.

Ресуспендируйте гранулу в пяти миллилитрах буфера для лизиса перед инкубацией при комнатной температуре в течение пяти минут для лизирования эритроцитов. Добавьте PBS, чтобы промыть клетки и удалить буфер для лизиса. Выдержите полученную одноклеточную суспензию на льду до дальнейшего использования.

Для центрифугирования с градиентом плотности сначала ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах 30%-ного раствора градиента плотности. Тщательно нанесите его на три миллилитра градиентного раствора 70% плотности в центрифужную пробирку. Центрифугируйте градиент при 500 G в течение 30 минут без перерыва.

После центрифугирования тщательно соберите слой раздела между 30% и 70% растворами. Дважды промойте собранные ячейки 10 миллилитрами PBS, и центрифугируйте каждую промывку при 500 G в течение 10 минут. Ресуспендируйте конечную клеточную гранулу в одном миллилитре буфера FACS в 1,5-миллилитровой пробирке.

Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра под светлопольным микроскопом и отрегулируйте концентрацию клеток до двух умножить на 10 в степени шести клеток на миллилитр. Поместите клетки в пробирки объемом 1,5 миллилитра, центрифугируя при 650 G в течение пяти минут, и повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре буфера FACS. Добавьте антитела против CD 16 или 32 в разведении от одного до 200, чтобы блокировать связывание неспецифических рецепторов FC.

После инкубации клеток в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия окрасьте клетки аква живым/мертвым красителем и предварительно конъюгированным коктейлем антител, включая CD45 E 450, CD11 B PE SI7, HCD59 PE и F4/80 BV 605. Добавьте коктейль антител непосредственно в клеточную суспензию. Инкубируйте образец в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия в темноте, чтобы защитить флуорофоры.

Затем дважды промойте ячейки буфером FACS. Зафиксируйте клетки в 1%-ном параформальдегиде на 30 минут на льду. Затем дважды промойте ячейки буфером FACS, чтобы удалить остатки фиксатора.

Приобретите окрашенные и неподвижные клетки с помощью проточного цитометра. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения. Определите резидентные макрофаги и микроглии почек и других тканей с помощью маркеров CD45, CD11B и F4/80.

Выполните начальное стробирование для выбора активных ячеек с помощью профилей прямого и бокового рассеивания. Устраните дублеты с помощью области прямого рассеивания в сравнении с стробированием по высоте. Исключите отмершие клетки с помощью красителя для повышения жизнеспособности.

Обогащайте иммунные клетки путем гейтирования на CD45-положительные популяции. Определите резидентные макрофаги почек как клетки CD11b+F4/80hi в пределах CD45-положительных ворот, как показано в стратегии гейтирования. Определите популяции микроглии как промежуточные клетки CD11b + CD45 и выполните окончательный анализ.

Одна заметная белковая полоса наблюдалась около 54 килодальтон в геле SDS, что подтверждает чистоту и ожидаемую молекулярную массу рекомбинантного интермедилизина. Очищенный интермедилизин проявлял сильную гемолитическую активность дозозависимым образом, достигая 50% лизиса эритроцитов при дозе 7,24 нанограмма на миллилитр и почти полного лизиса при дозе 650 нанограмм на миллилитр. Анализ проточной цитометрии подтвердил успешное и избирательное истощение почечных макрофагов у индуцируемых человеческих мышей с соединением CD59 cre-R через сутки после введения интермедиализина, без истощения у контрольных мышей.

Почечные макрофаги начали восстанавливаться на третий день и восстановились примерно до 88% от своей первоначальной популяции к седьмому дню. Только 5% вновь регенерированных почечных макрофагов экспрессировали человеческий CD59 к седьмому дню, что указывает на то, что репопуляция в основном происходила за счет рекрутирования моноцитов, а не пролиферации in situ.