Выделение, фиксация и характеристика лейкоцитов почки ювенильной головы морского леща методом проточной цитометрии

Этот протокол стандартизирует выделение, фиксацию и оценку жизнеспособности лейкоцитов из головной почки морского леща с помощью проточной цитометрии, что позволяет проводить высокопроизводительную обработку образцов без ущерба для качества.

Традиционные методы, такие как ручной подсчет клеток с помощью камер Нейбауэра и мазки окрашенной крови, распространены в иммунологии рыб. Проточная цитометрия становится все более популярной, но ее применение в исследованиях рыб остается ограниченным. Традиционные методы иммунологии рыб интенсивно работают на печень и подвержены ошибкам. Исследования на ювенильных животных ограничены проблемами получения чистых лейкоцитов и необходимостью немедленной оценки жизнеспособности, что ограничивает пропускную способность образца.

Этот протокол позволяет проводить детальный анализ иммунных клеток, выявляя ключевые популяции лейкоцитов и отличая живые клетки от мертвых. Фиксация сохраняет жизнеспособность в течение месяца, обеспечивая масштабируемые, гибкие и эффективные рабочие процессы проточной цитометрии.

Наши результаты способствуют развитию иммунологии рыб, выявляя иммунные механизмы и влияние окружающей среды на жизнеспособность клеток, способствуя разработке улучшенных стратегий борьбы с болезнями в аквакультуре.

[Рассказчик] Для начала следует акклиматизировать молодь золотистого морского леща (Sparus aurata) в замкнутых системах аквакультуры, где вода постоянно фильтруется и рециркулируется для поддержания стабильной окружающей среды. Убедитесь, что система включает механическую и биологическую фильтрацию, аэрацию и контроль температуры для поддержания оптимальных абиотических параметров. Отрегулируйте факторы окружающей среды, такие как фотопериод, температура, соленость, pH и уровень растворенного кислорода, в соответствии с конкретными потребностями исследования. С помощью сачка осторожно переложите молодь морского леща в контейнер для временного хранения, наполненный водой из аквариума. После усыпления рыбы положите одну рыбу на бок на стерильный лоток для вскрытия. Скальпелем сделайте аккуратный надрез по вентральной средней линии рыбы от отверстия к жабрам. Используйте ножницы для рассечения, чтобы расширить разрез и обнажить внутренние органы. Найдите головную почку, которая расположена сразу за жабрами рядом с передней дорсальной областью полости тела и простирается вдоль верхней стороны под позвоночным столбом. С помощью щипцов и ножниц с тонкими наконечниками осторожно очистите окружающие ткани, чтобы лучше визуализировать головную почку. Затем поднимите головную почку и сделайте точные надрезы вокруг нее, чтобы освободить ее от окружающих тканей. Немедленно поместите отрезанную почку головки в сетчатое ситечко, расположенное в стерильной чашке Петри. Пипеткой нанесите два миллилитра сбалансированного солевого раствора Хэнкса, или HBSS, в стерильную чашку Петри. Размачивайте вырезанную головку почки на клеточном фильтре с помощью поршня шприца, чтобы выпустить клетки в раствор. Далее приготовьте градиент плотности среднего раствора. Пипеткой наберите 600 микролитров градиентного раствора среды плотности в пятимиллилитровые полистирольные пробирки с круглым дном. Медленно перенесите по два миллилитра клеточной суспензии из чашки Петри в каждую пробирку. Центрифугируйте при 400г в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия с выключенным тормозом. После центрифугирования извлеките пробирку и понаблюдайте за лейкоцитарным кольцом. Затем с помощью стерильной пастеровской пипетки аккуратно перенесите примерно 100 микролитров лейкоцитарного кольца в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. Теперь восполните объем до двух миллилитров с помощью HBSS и аккуратно ресуспендируйте клетки. Центрифугируйте образец при 400 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования осторожно выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулу на дне пробирки. Затем повторно суспендируйте очищенную гранулу в одном миллилитре HBSS до тех пор, пока конечная концентрация клеток не составит от 10 000 до одного миллиона клеток на миллилитр. Добавьте 50 микролитров диметилсульфоксида во флакон, содержащий реактивный краситель. После регулировки плотности клеток до одного миллиона клеток на миллилитр перелейте один миллилитр клеточной суспензии в двухмиллилитровые микроцентрифужные пробирки. Подготовьте образцы для контроля жизнеспособности в соответствии с данными. Вызвать гибель клеток в третьей и четвертой пробирках, поместив их на водяную баню при температуре 70 градусов Цельсия на семь минут. Чтобы окрашивать клетки, пипеткой нанесите один микролитр восстановленного флуоресцентного красителя в пробирки 2 и 4, содержащие один миллилитр клеточной суспензии, и хорошо перемешайте. Инкубируйте испачканные трубки при комнатной температуре в течение 30 минут, защищенных от света. Далее дважды промойте ячейки одним миллилитром HBSS, и ресуспендируйте итоговую гранулу в 900 микролитрах того же буфера. Затем пипеткой 100 микролитров 37% формальдегида для фиксации клеток, и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут. После двукратного промывания клеток одним миллилитром HBSS, содержащим 1% BSA, повторно суспендировать в одном миллилитре того же раствора. Храните образцы при температуре четыре градуса Цельсия в холодильнике до одного месяца. Поместите неподвижную пробирку с образцом в порт проточного цитометра для анализа. Запишите не менее 10 000 событий для каждого образца в пределах синглетного вентиля. Сохраняйте все данные и создавайте резервные копии на внешних дисках или в облачном хранилище. Визуализируйте данные проточной цитометрии, построив график прямой области рассеяния в зависимости от боковой области рассеяния для оценки размера и гранулярности клеток. Выполните стробирование синглетных ячеек и исключите мультиплеты, построив график прямой площади рассеяния verus forward scatter height. Определите три популяции лейкоцитов на основе профилей прямого и бокового рассеяния. Установите порог окрашивания красителя на жизнеспособность в соответствующем флуоресцентном канале, чтобы различать живые и мертвые клетки. В оптимальных условиях лимфоциты, моноциты и гранулоциты составляли 31%, 38% и 31% популяции лейкоцитов соответственно, в то время как при термическом стрессе лимфоциты снижались до 21,3%, моноциты увеличивались до 45,6%, а гранулоциты оставались стабильными на уровне 33,1%. Образец, подвергшийся воздействию оптимальных условий, продемонстрировал более высокую жизнеспособность с преобладанием живых клеток во всех популяциях лейкоцитов. Напротив, термически напряженный образец показал значительное увеличение гибели клеток.