Протокол электропорационной цитометрии для флуоресцентной микроскопии живых клеток с использованием культуры клеток U2 OS

В рамках данного исследования основное внимание уделяется влиянию импульсных электрических полей на поведение клеток, в частности, на том, как электропорация влияет на клеточный цикл.

Основным преимуществом этого протокола является возможность проведения непрерывных экспериментов по электропорации живых клеток с использованием культуры клеток млекопитающих в течение 72 часов. Наша лаборатория сосредоточена на адаптации этих методов к микрофлюидике, что позволит уменьшить размеры образцов, снизить потребность в реагентах и улучшить контроль образцов для будущих протоколов.

[Рассказчик] Для начала культивируют клетки U2OS FUCCI CA5 в 10-сантиметровом планшете с 10 миллилитрами высокой глюкозы DMEM, содержащей 10% FBS и 1% пенициллина стрептомицина. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в среде с 5% содержанием углекислого газа. Когда культура достигнет 80% конфлюенции, отсасывайте среду из тарелки. Промойте клетки PBS, затем добавьте один миллилитр 0,25% трипсина и инкубируйте в течение 1,5 минут для диссоциации клеток. Нейтрализуйте трипсин путем ресуспендирования диссоциированных клеток в пяти миллилитрах DMEM с высоким содержанием глюкозы. Получите образец объемом 100 микролитров из ресуспендированной культуры и поместите его на нижнюю стеклянную крышку стекла внутрь камеры системы электропорации цитометрии. После введения образца убедитесь, что камера сливается на 30%. Медленно добавьте четыре миллилитра DMEM с высоким содержанием глюкозы в дальний конец камеры, не допуская вымывания жидкости из образца. Поместите стандартное предметное стекло микроскопа над камерой и инкубируйте камеру при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов. Включите инвертированный флуоресцентный микроскоп с камерой контроля окружающей среды, чтобы система стабилизировалась перед электропорацией. Пока климатическая камера стабилизируется, используйте кабели типа «крокодил» для подключения цифрового мультиметра к конденсатору импульсного генератора и высоковольтному выключателю для быстрой настройки с камерой электропорации. Теперь выберите 20-кратное увеличение на микроскопе. В программном обеспечении микроскопа убедитесь, что выбраны каналы FITC/GFP и A594 Texas Red M Cherry, соответствующие двум флуоресцентным белкам в системе FUCCI CA5. Используйте низкие настройки выдержки, обычно менее 0,05 секунды, чтобы предотвратить повреждение фотографий при длительном съемке. Сделайте тестовые снимки для оптимизации фокусировки и качества изображения, прежде чем начинать цейтраферную съемку. Запрограммируйте интервальную съемку таким образом, чтобы каждые 10 минут в течение 24 часов захватывать изображения с трех-шести различных точек обзора, чтобы получить большой объем данных о клеточном цикле за интервал съемки и уменьшить повреждение фотографий. Убедитесь, что автофокусировка включена для канала A594, чтобы оптимизировать отслеживание культуры во время интервальной съемки. Оставьте программное обеспечение открытым до завершения электропорации. Поместите камеру электропорационной цитометрии в микроскоп, оборудованный соответствующей климатической камерой. Перед электропорацией держите камеру закрытой и убедитесь, что система окружающей среды продолжает работать для поддержания надлежащих условий клеточного цикла. Откройте климатическую камеру и прикрепите к генератору импульсов цифровой мультиметр, затем с помощью кабелей из крокодила-зажима подключите генератор импульсов к электродам камеры. Зарядите конденсатор генератора импульсов до 180 вольт. Быстро подавайте импульс в камеру до тех пор, пока цифровой мультиметр не покажет ноль вольт. Снимите все электрические соединения с камерой и незамедлительно установите на место крышку камеры, чтобы обеспечить оптимальные условия культивирования. Активируйте покадровую съемку сразу после того, как климатическая камера будет надежно установлена на месте. После завершения интервальной съемки используйте программное обеспечение микроскопа для сохранения всех отснятых изображений в виде одного видео. Настройте визуальное качество для повышения четкости характеристик ячеек для ручной количественной оценки. Наконец, наблюдайте за изменениями сигналов FITC и A594 с течением времени, чтобы отслеживать фазы ячейки в видео с замедленной съемкой. С помощью системы Fuji были собраны визуальные данные путем отслеживания изменений цвета, связанных с экспрессией белка и убиквитинацией, что позволило четко различить фазы G1, S, G2, M. Это позволило напрямую наблюдать за прогрессией клеточного цикла в различных условиях. На этом рисунке представлена сводка ключевых данных, собранных в двух сериях экспериментов с использованием несинхронизированных и синхронизированных по S-фазе клеточных культур. Воздействие импульсного электрического поля в несинхронизированных ячейках достоверно увеличивало среднюю длину фаз G1, G2 и M, в то время как S-фаза оставалась неизменной. В синхронизированных клетках воздействие импульсного электрического поля приводило к уменьшению продолжительности фаз G1, S и G2, хотя только S и G2 были статистически значимыми, в то время как М-фаза оставалась неизменной.