Хемогенетическая регуляция в перепрограммированных клетках-предшественниках, полученных из стволовых клеток, в лечении нейродегенеративных заболеваний

Наши исследования сосредоточены на иллюстрации патогенетического механизма, лежащего в основе нейродегенеративного заболевания, при одновременной интеграции передовых технологий для разработки эффективных методов клеточной терапии для клинического применения. В нашей недавней работе были трансплантированы химиогенетически модифицированные стволовые клетки в мышиных моделях болезни Паркинсона. Мы модулируем активность нейронов одной клетки с помощью дизайнерских препаратов, поэтому электрофизиологический мониторинг и поведенческая оценка. В основном мы используем CRISPR для генной инженерии, электрофизиологии для мониторинга нейронной активности и поведенческого анализа для оценки восстановления функций в моделях болезни Паркинсона. Эффективность трансплантатов повышается при правильной индикации, выживаемости и функциональном вкладе в ткань хозяина при терапии на основе стволовых клеток, лечении нейродегенеративных заболеваний. Неконтролируемая клеточная активность, связанная с негативными последствиями, в том числе с опухолевым генезом.

Использование технологии в перепрограммированных стволовых клетках человека и нейронах-драйверах дает средства для точного управления нейронной активностью путем введения дизайнерского препарата CNO.

[Инструктор] Для начала аккуратно смешайте от 50 до 100 нанограммов линеаризованного вектора, фрагмент один и фрагмент два, в соотношении один к трем молярам, вместе со смесью для клонирования 2X. Инкубируйте смесь при температуре 55 градусов Цельсия в течение одного часа, чтобы облегчить гомологичную рекомбинацию с помощью сборки Gibson. Вставьте направляющую РНК, нацеленную на сайт AAVS1, в сайт BBS1 вектора PX458. Поддерживайте перепрограммированные стволовые клетки в питательных средах, стремясь к плотности клеток от двух до 5 миллионов клеток на миллилитр. Теперь смешайте от двух до 5 миллионов клеток, по два микрограмма каждой донорской плазмиды и два микрограмма плазмиды GRNA в 100 микролитрах электропорационного буфера. Перенесите смесь клеток и плазмид в кювету для проведения электропорации. Затем перенесите электропорированные ячейки в шестилуночные планшеты, покрытые поли-D-лизином и ламинином. Распределите примерно 500 000 клеток в лунку в двух миллилитрах питательной среды. После 72 часов электропорации используйте проточный цитометр для сортировки флуоресцентных положительных клеток. Настройте сортировщик с каналом FITC для обнаружения ZsGreen. Включите необработанные индуцированные нейральные стволовые клетки в качестве отрицательного контроля для определения исходной флуоресценции. Поместите отдельные ZsGreen-положительные клетки в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые поли-D-лизином и ламинином, и добавьте 200 микролитров питательной среды в лунку. Выдерживайте культуру от семи до 14 дней. Выделите отдельные клоны, проявляющие флуоресценцию, с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, оснащенного зеленым набором фильтров флуоресцентных белков. После размножения положительных клеток на покрытых покрытием 48-луночных планшетах разделите их на две части, одну для продолжения культивирования, а другую для генотипирования. Извлечь геномную ДНК из клонов-кандидатов. Приготовьте смесь для ПЦР с использованием двух основных методов репарации, один для подтверждения вставки интересующего гена, а другой для различения гомозиготных и гетерозиготных клонов. Переварите клетки, промойте их в PBS и центрифугируйте при 250 G в течение трех минут. Проводят односторонние стереотаксические инъекции трех микролитров 6-гидроксидофамина в концентрации пять микрограммов на микролитр обезболиванному животному. Нацельтесь на правое полосатое тело по правильным координатам. Введите внутрибрюшинную инъекцию апоморфина в дозе один миллиграмм на килограмм с использованием раствора 0,5 миллиграмма на миллилитр, растворенного в физрастворе через четыре недели после операции, чтобы подтвердить поражения. Введите стереотаксическую инъекцию четырех микролитров приготовленной клеточной суспензии в мышиную модель с болезнью Паркинсона. Проведите тест с цилиндром в несколько временных точек после трансплантации клеток. Поместите стеклянный стакан диаметром 20 сантиметров и высотой 30 сантиметров на плоскую поверхность с неотражающими свойствами. Затем расположите камеру верхнего вида над цилиндром, чтобы захватить весь диаметр. Поместите каждую мышь в центр цилиндра и начните одновременную запись видео в течение трех минут за сеанс. После сеанса верните мышь в домашнюю клетку. Оцените движение верхних конечностей мышей в течение трехминутного сеанса. Рассчитайте количество контактов со стенками, сделанных поврежденной передней конечностью, по отношению к общему количеству контактов, сделанных обеими передними конечностями. Вводите либо физиологический раствор, либо N-оксид клозапина в дозировке 1,2 миллиграмма на килограмм путем внутрибрюшинной инъекции. Проведите цилиндрический тест еще раз для оценки поведенческой модуляции в мышиной модели с болезнью Паркинсона после введения N-оксида клозапина. После извлечения мозга у животного, находящегося под наркозом, немедленно поместите его в ледяную искусственную спинномозговую жидкость на основе сахарозы для сохранения клеточной целостности С помощью вибратома разрежьте мозг на участки толщиной от 300 до 400 микрометров. Отрегулируйте настройки подачи газа так, чтобы он уравновешивался с 95% кислорода и 5% углекислого газа при температуре 34 градуса Цельсия. Перенесите срезы мозга в камеру, заполненную искусственной спинномозговой жидкостью. Загрузите стеклянные пипетки ледяным внутриклеточным раствором, обеспечив сопротивление электродов в диапазоне от 7 до 10 МОм. Монтируйте срезы в погружную записывающую камеру, переплавленную со скоростью два миллилитра в минуту с кислородной искусственной спинномозговой жидкостью при температуре 34 градуса Цельсия. Позиционирование пипеток с помощью моторизованных микроманипуляторов в инфракрасной дифференциально-интерференционной контрастной микроскопии. Установите конфигурацию всей клетки с помощью мягкого отсасывания, чтобы залатать нейроны с сопротивлением более одного гигаома. Зажмите клетки при напряжении минус 70 милливольт с помощью усилителя с патч-клемом и получите исходные спонтанные возбуждающие постсинаптические токи в течение восьми минут с частотой дискретизации 10 килогерц. Добавьте 50 микромолярных N-оксидов клозапина в записывающую камеру сразу после исходного измерения. Продолжайте записывать данные в течение 16 минут и отслеживайте изменения частоты или амплитуды спонтанного возбуждающего постсинаптического тока. Наконец, выполните процедуру вымывания, заменив раствор клозапина N-оксида свежей искусственной спинномозговой жидкостью, и продолжайте запись для оценки восстановления синаптической активности. Гемогенетическая модуляция с использованием N-оксида клозапина снижала контралатеральную подвижность передних конечностей у мышей, пересаженных с помощью hM4Di, и увеличивала ее у мышей, пересаженных с помощью солевого раствора, демонстрируя двунаправленный поведенческий контроль. Электрофизиологические записи показали, что трансплантированные клетки hM4Di имели более длинные интервалы и меньшие пиковые амплитуды в спонтанных возбуждающих постсинаптических токах, в то время как трансплантированные клетки hM3Dq имели более короткие интервалы и большие амплитуды, что указывает на соответствующее подавление и усиление синаптической активности. Иммунофлуоресцентный анализ подтвердил in vivo экспрессию тирозингидроксилазы и ZsGreen в трансплантированных клетках hM4Di и hM3Dq, что способствует успешной интеграции трансплантата.