Биореакторная сборка для непрерывного культивирования сложных фекальных сообществ

Мы изучаем взаимодействие бактерий-хозяев и то, как внутренние и внешние факторы влияют на здоровье, уделяя особое внимание влиянию бактерий на развитие, прогрессирование рака и реакцию на лечение. Мы изучили ингибиторы иммунных контрольных точек анти-PD-1 в бактериальных сообществах и обнаружили, что бактериальные метаболиты повышают эффективность анти-PD-1 терапии.

Выделение влияния факторов хозяина на микробиом in vivo является сложной задачей из-за множественных воздействий. Микробиореакторная решетка позволяет контролировать конкретные процессы, выясняя их прямое влияние на микробные сообщества. Этот протокол предлагает экономически эффективный метод культивирования фекальных сообществ в контролируемых условиях, позволяя исследователям проводить параллельные эксперименты относительно быстро.

[Инструктор] Для начала приобретите напечатанный на 3D-принтере массив из шести скважин. Вырежьте двенадцать 25-миллиметровых полосок из трубки из ПТФЭ диаметром 1/8 дюйма и с помощью бритвы сбрите кончики. Вставьте по одному концу каждой полосы в отверстие с резьбой винта наружной резьбы Luer с резьбовым фитингом от 25 до 28 метров. Надежно вкрутите фитинги в предназначенные для этого отверстия для слива и отбора проб массива. Теперь вставьте стержень микромешалки в каждую лунку реактора. Вкрутите фитинг с наружной резьбой 1/4-28 в исходные отверстия каждой реакторной лунки. Вкрутите переходные фитинги для шланга Luer с внутренней резьбой в резьбовые фитинги для сливных и исходных соединений каждой скважины реактора. Затем вкрутите гнездовые фитинги Luer X к 3-32/2-дюймовым переходникам для шланга в фитинги с резьбой 1/4-28 для отверстий для образцов. Наденьте резиновую перегородку на адаптеры шипов шланга и откиньте верх. Затем отрежьте два комплекта трубок E-LFL 2,06 мм для отвода отходов и трубопровода источника. Используйте горячую воду, чтобы размягчить трубку для облегчения прикрепления. Прикрепите трубку к внутренней резьбе Luer X к 1/8-дюймовым фитингам переходника для шланга для соединения источника и слива. Теперь закрепите наружный луэр с помощью стопорного кольца X на 1/8-дюймовый переходник для шланга с шипом на другом конце трубки. Вкрутите в него вставной адаптер для шланга Luer X с внутренней резьбой Luer X на 1/16 дюйма. Подсоедините двухступенчатую трубку соответствующего размера к соответствующему источнику и сливу. Затем закрепите еще один фитинг с внутренней резьбой Luer X на 1/16 дюйма с переходником для шланга с шипом на другом конце трубки. Повторив это для всех исходных и сливных фитингов, вставьте наружную вилку Luer с стопорным кольцом X в 1/8-дюймовые фитинги для переходника шланга с заусенцами в кусок трубки E-LFL 2. Прикрепите один конец к незанятому переходнику для шланга Luer X на 1/16 дюйма в конце каждой секции трубки с двумя ступенями для всех частей. Повторив это для всех исходных и отходных фитингов, подсоедините трубку E-LFL 2,06 мм для трубопроводов источника первого и второго скважин реактора, используя противоположные концы внутренней лунки Luer T. Затем закрепите пятисантиметровый кусок трубки с наружной резьбой Люэра со стопорным кольцом X на 1/8 дюйма переходными фитингами на каждом конце к среднему выходу Т-образного отверстия, что приведет ко второму Т-образному соединению. Теперь подсоедините трубку источника E-LFL 2,06 миллиметра для третьего реактора к противоположной стороне второго Т. Прикрепите еще один пятисантиметровый сегмент трубки, имеющий наружную трубку Луэра с фиксирующим кольцом X на 1/8 дюйма на одном конце и внутреннюю трубку Луэра с стопорным кольцом X на 1/8 дюйма на другом. Затем прикрепите наружный луэр со стопорным кольцом X к переходнику для шланга 1/8 дюйма к одному концу 25-сантиметрового куска трубки E-LFL 2,06 мм. Закрепите гнездовой адаптер Luer X на 1/8-дюймовый штуцер для шланга с другим концом и закройте его алюминиевой фольгой. Чтобы собрать бутылку для сбора отходов, неплотно закрепите крышку с двумя отверстиями на двухлитровой бутылке. Вставьте фитинги с наружной резьбой 1/4-28 в оба отверстия колпачка. Затем прикрепите гнездовой луэр с переходником для шланга 1/8 дюйма к фитингу с наружной резьбой, который не соединяется с предварительно прикрепленной трубкой из ПТФЭ в колпачке. Подсоедините пятисантиметровый кусок трубки E-LFL 2,06 мм к переходнику для шланга на бутылке. Прикрепите наружную вилку Luer со стопорным кольцом X к адаптеру для шланга 1/8 дюйма к другому концу трубки, прежде чем накрыть ее фольгой. Наконец, накройте всю крышку бутылки алюминиевой фольгой перед автоклавированием при температуре 121 градус Цельсия и 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 45 минут. После завершения автоклавирования затяните фитинги и уплотнения из фольги и поместите реакторы в анаэробную камеру на 48 часов перед использованием. Выровняйте реакторную решетку внутри анаэробной камеры над магнитной мешалкой, установленной на 1 600 об/мин. Затем установите трубки с двумя остановками для трубопроводов источника и слива в зажимы соответствующих перистальтических насосов. Зафиксируйте зажимы на месте, если это сделано менее чем за 25 часов до использования. В противном случае оставьте его свободным, чтобы уменьшить износ трубки. Теперь снимите крышку из фольги с исходной бутылки. Вкрутите фитинги в фитинги с наружной резьбой Люэра на резьбу 1/4-28, убедившись, что эти отверстия соединены с внутренней трубкой из ПТФЭ. Снимите крышки из фольги и прикрепите шприцевой фильтр 0,22 микрометра к пятисантиметровой вентиляционной линии как исходной бутылки, так и бутылки для отходов. Начните подачу с умеренной скоростью, чтобы начать заполнение реактора. Убедитесь, что поясная трубка внутри каждой реакторной скважины расположена ниже исходной трубки, чтобы предотвратить переполнение или полное опорожнение каждой скважины. Когда реакторы начнут заполняться, убедитесь, что все скважины достигли одинакового объема и что среда течет в поясницу, прежде чем покидать реакторы для дегазации на ночь. Начните с переноса экспериментальных материалов в анаэробную камеру на 24 часа. После расчета необходимого количества калового посева перенесите сохраненные образцы кала в криогенных флаконах в анаэробную камеру и дайте им оттаять в течение 15 минут. С помощью наконечника пипетки с широким отверстием переведите каловый материал из криогенных флаконов в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте герметичную пробирку при температуре 200 г в течение пяти минут, чтобы частицы осели. Перенесите трубки обратно в анаэробную камеру. Затем удалите надосадочную жидкость. С помощью автоклавного лабораторного шпателя перенесите 5,7 грамма твердых каловых масс в новую 50-миллилитровую коническую пробирку. Добавьте в пробирку 17,1 миллилитров анаэробного стерильного физиологического раствора и плотно закупорьте. Теперь скорректируйте пробирку в течение пяти минут перед центрифугированием, как было показано ранее. Используйте лабораторную салфетку с 10% отбеливателем, чтобы стерилизовать перегородки на вершине каждого реактора в течение не менее двух минут. После возвращения образцов в анаэробную камеру дозируйте надосадочную жидкость в новые 50-миллилитровые конические пробирки. Теперь перелейте 3,8 миллилитра надосадочной жидкости в шесть отдельных пятимиллилитровых шприцев, оснащенных 16-дюймовыми иглами 16-го калибра. Снимите отбеливающую салфетку с перегородок реактора. Затем введите иглу через перегородку и медленно введите по 3,8 миллилитров каловой суспензии в каждый реактор, прежде чем оставить реакторы на ночь. После 16-18-часовой инкубации запустите подачу в реактор. Установите магнитную мешалку на максимальную скорость сразу после впрыска каловой суспензии. Состав микробного сообщества в обоих реплицируемых реакторах менялся с течением времени, при этом разные виды демонстрировали переменную относительную численность в течение нескольких дней. Привередливые анаэробные бактерии, такие как роды Clostridium, были последовательно обнаружены в каждом реакторе во все моменты времени.