Генерация и характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека астроцитов, лишенных хрупкого рибонуклеопротеина X-мессенджера

Эта работа посвящена четырем специфическим для мозга человеческим астроцитам и тому, как они изменяются под воздействием нарушений развития нервной системы, таких как синдром ломкой X-хромосомы. В более ранних работах использовались животные модели для изучения в основном нейронов, поэтому эта работа добавляет новое измерение в эту область исследований.

Механистические выводы из исследований на животных имели ограниченный клинический успех. Основная задача состоит в том, чтобы получить аналогичное представление о нейронах и астроцитах человеческого происхождения.

Наш протокол успешно сгенерировал функциональные для ветра специфические астроциты, которые демонстрируют нарушенный, гликолитический и митохондриальный метаболизм при синдроме ломкой X-хромосомы, что позволило исследовать роль глиальных клеток в биологии заболеваний. Несмотря на растущее количество доказательств ключевой роли глии в функционировании нейронов в норме здоровья и болезней, мало что известно о том, как астроциты человека влияют на нарушения развития нервной системы, такие как синдром ломкой X-хромосомы.

Заглядывая в будущее, мы будем опираться на эту схему, чтобы изучить, как астроциты и их взаимодействие с нейронами изменяются под воздействием болезней, а затем как они могут быть скорректированы с помощью терапевтических вмешательств.

[Инструктор] Для начала покройте чашку с шестью волнами Матригелем, разведенным в соотношении один к 60 в усовершенствованном DMMF 12. Храните покрытое покрытием блюдо при температуре от двух до восьми градусов Цельсия. В день культивирования удалите материал покрытия из чашки и добавьте один миллилитр полной среды essential eight вместе с ингибитором горных пород в конечной концентрации один X. Поместите чашку в инкубатор. Установите температуру 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа перед добавлением индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, или IPSC. Засейте человеческие IPSC в полную среду из восьми основных сред с ингибитором горных пород в конечной концентрации 1 X для улучшения адгезии колонии. На следующий день замените полную среду essential eight на свежую среду, в которой отсутствует ингибитор горных пород. Продолжайте пополнять среду ежедневно до тех пор, пока клетки не достигнут 80% слияния, что занимает примерно четыре-пять дней. Когда колонии достигнут 80% слияния, добавьте смесь коллагеназы и распыляйте, чтобы ферментативно отделить их от чашки. Как только колонии начнут подниматься, достаньте чашку из инкубатора и добавьте два миллилитра DPBS для нейтрализации активности ферментов. С помощью DPBS соскребите колонии и соберите суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, используя широкую плату серологической пипетки объемом 10 миллилитров. Затем с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров осторожно растирайте суспензию два-три раза, чтобы разбить колонии. Позвольте колониям заселиться. Примерно через две минуты аспирируйте смесь ферментов DPBS, оставляя в пробирке примерно один миллилитр жидкости. Затем добавьте в пробирку два миллилитра DPBS и перемешайте, слегка постукивая, чтобы снова суспендировать колонии. Дайте им осесть, и повторите этот процесс два раза, чтобы удалить остатки фермента. После удаления надосадочной жидкости снова суспендируйте колонии в одном миллилитре полной эфирной среды и положите их в свежеприготовленную посуду, покрытую Матригелем. Ферментативный лифтинг индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, как описано ранее. Выложите их на 100-миллиметровую чашку для культивирования суспензии с химически определенной средой. Поместите клеточную суспензию на орбитальный шейкер со скоростью 40 оборотов в минуту в течение семи дней в нормоксических условиях, чтобы способствовать развитию кортикосфер. На восьмой день перенесите кортикосферы в среду для пролиферации клеток и поддерживайте их в течение семи дней. Чтобы индуцировать глиальную спецификацию, инкубируйте кортикосферы в глиальной обогащающей среде в течение двух недель, чтобы получить ранние глиальные сферы. Для созревания ранних сфер глии замените основной фактор роста фибробластов H на 20 нанограммов на миллилитр ингибиторного фактора лейкемии и поддерживайте сферы в течение четырех недель.

После четырех недель в среде созревания продолжайте поддерживать сферы в среде для глиального обогащения в течение длительного времени. Чтобы предотвратить агрегацию и потерю жизнеспособности, каждые две недели механически измельчайте сферы глии, используя стерильное промышленное лезвие. Замените всю среду на ДНКазу, чтобы удалить фрагменты ДНК, полученные в результате измельчения. Затем диссоциируйте сферы глии на монослои клеток-предшественников астроцитов с помощью набора для диссоциации папаина. Поместите диссоциированные клетки на клеточную культуру, обработанную адгезивную чашку, предварительно покрытую Матригелем в разведении от одного до 80. Размножайте клетки-предшественники астроцитов в глиальной среде, обогащенной до тех пор, пока они не достигнут 80% конфлюенции. При прохождении клеток удаляется отработанная среда и собирается ее в коническую трубку. Добавьте к клеткам ферментную среду для отслоения клеток и подождите одну-две минуты. Как только клетки начнут отделяться, добавьте отработанную среду для нейтрализации активности фермента. Соберите клеточную суспензию и центрифугируйте при 800 G в течение двух минут. После отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендируйте клетки в среде для глиального обогащения. Нанесите примерно один умножить на 10 в степени шести клеток на лунку на чашку, покрытую Матригелем, в разведении от одного до 80. Для криоконсервации повторно суспендируйте клеточную гранулу в холодной смеси, состоящей из 90% пролиферационной среды кортикосферы и 10% криопротектора. Переложите повторно суспендированные клетки в криопробирки. Немедленно переместите криофлаконы в криобокс и храните в морозильной камере при температуре минус 80 градусов Цельсия на ночь. На следующий день переложите все криопробирки в резервуар с жидким азотом для длительного хранения. Охарактеризовать диссоциированные клетки-предшественники астроцитов путем иммуноокрашивания маркерами Виментона и ядерного фактора IAM. Чтобы подтвердить специфичность по четырем регионам мозга человека, полученных из IPSC, проведите анализ QPCR в режиме реального времени для коробки головки вилки человека G1 и гомеокороба человека, B4. Дифференцировать АПК на астроциты и среду для дифференцировки астроцитов в течение 14 дней. Пластины астроцитов на 35-миллиметровом стеклянном дне чашки с плотностью пять умножить на 10 в степени трех клеток на чашку, чтобы измерить их реакцию на аденозин-5 трифосфат. Дайте ячейкам прилипнуть к стеклянному дну в течение 24 часов. Промойте прилипшие клетки трижды сбалансированным солевым раствором Хэнка без кальция. Затем инкубируют клетки в питательной среде, содержащей пять микромолярных метрических диуреидов 2:00 AM и 0,02% pluronic F127, в течение одного часа при комнатной температуре. После двукратной промывки клеток питательной средой замените среду двумя миллимолярами кальция, содержащими раствор сбалансированной соли Хэнка. Визуализируйте ячейки со скоростью два кадра в секунду с помощью 60-кратного масляного иммерсионного объектива на инвертированном микроскопе с компенсацией сфокусированного дрейфа. Наконец, запись АТФ индуцировала кальциевые реакции после добавления АТФ в конечной концентрации пять миллимоляров на 25-секундной отметке. Человеческие колонии IPSC экспрессировали плюрипотентные маркеры OPT и NANO, что подтверждается иммуноокрашиванием. АПК, полученные из синдрома ломкой Х-хромосомы, и контрольные линии показали сопоставимые пропорции виментина и NFIA-положительных клеток. Клетки-предшественники астроцитов как из контрольных, так и из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток с синдромом ломкой Х-хромосомы продемонстрировали повышенную регуляцию Fox G1 по сравнению с HOXB4, что указывает на идентичность переднего мозга. Астроциты, полученные из линий синдрома ломкой Х-хромосомы IPSC человека, показали сниженное количество экспрессии GFAP. Контрольные астроциты и астроциты с синдромом ломкой Х-хромосомы демонстрировали индуцированные АТФ переходные процессы кальция, но число ответивших было значительно ниже в астроцитах с синдромом ломкой Х-хромосомы. Пиковая амплитуда первого АТФ-вызванного кальциевого транзиента была значительно ниже в астроцитах с синдромом хрупкой Х-хромосомы по сравнению с контрольными клетками. Астроциты с синдромом ломкой X-хромосомы человека, полученные из IPSC, показали увеличение гликолиза, гликолитической способности и гликолитических резервов, но показали значительное снижение максимального дыхания по сравнению с контрольными астроцитами.