Выделение и культивирование первичных клеток Мюллера сетчатки у крыс Sprague-Dawley (SD)

Этот протокол описывает выделение и культивирование первичных клеток Мюллера сетчатки от крыс Sprague-Dawley SD, что может помочь в исследованиях сетчатки в научном сообществе. Протокол охватывает диссекцию сетчатки, экстракцию и идентификацию КИ, а также ключевые аспекты контроля. Этот протокол обеспечивает эффективный, стандартизированный и экономичный метод извлечения и восстановления RMC из легальных стоек SD. Модель RMC может быть использована для моделирования патологических состояний, таких как диабет, нормальность и помощь в воздействии лекарств.

[Рассказчик] Для начала вылейте раствор D-Hank's в две 10-сантиметровые стеклянные посуды для культуры. После усыпления и дезинфекции новорожденной крысы SD поместите ее на стерильную изогнутую посуду. С помощью зубного пинцета разорвите кожу века вдоль глазной щели, чтобы обнажить глазное яблоко крысы. Держите беззубый пинцет открытым и параллельным глазной щели, чтобы надавить на орбиталь. Как только зрительный нерв будет достигнут и глазное яблоко обнажено, закройте пинцет, чтобы поднять и извлечь глазное яблоко. Теперь поместите глазное яблоко в стеклянную чашку для культуры с раствором Д-Хэнка. Промойте глазное яблоко и переложите его в другую посуду со свежим раствором D-Hank's. Затем с помощью изогнутых офтальмологических микрощипцов аккуратно зафиксируйте область между роговицей и зрительным нервом, чтобы обнажить роговицу. Проткните склеральное соединение роговицы с помощью микроножниц для роговицы и разрежьте вдоль лимба круговым образом. Сделайте два симметричных склеральных разреза длиной примерно два миллиметра перед освобождением щипцов и наложением зажима на стыке зрительного нерва и склеры. Затем с помощью второго щипца осторожно надавите рядом с корешком зрительного нерва, направляя давление на интерфейс зрительного нерва роговицы. Когда появится хрусталиковая ткань, осторожно удалите ее и продолжайте надавливание до тех пор, пока не появится ткань сетчатки. С помощью щипцов перенесите отделенную ткань сетчатки в другую стерильную чашку для посева. Откройте крышку чашки для культивирования и с помощью пипетки с наконечником объемом в один миллилитр пипеткой вверх и вниз около 15 раз, чтобы разбить ее на мелкие кусочки. Затем инкубируйте ткань с одним миллилитром 0,25% трипсина при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Выньте чашку для культуры из инкубатора и поставьте ее на чистую скамейку. Добавьте два миллилитра готовой среды и аккуратно пипеткой, чтобы остановить пищеварение. Теперь отфильтруйте клеточную суспензию через нейлоновое сито с 300 меш в центрифугу объемом 15 миллилитров два. Вымойте чашку для культуры с подготовленным ПБС и соберите оставшуюся взвесь. Затем вращайте трубку при температуре 878 G в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах готовой среды и снова центрифугируйте при 878 G в течение пяти минут для очистки клеток. После сброса надосадочной жидкости ресуспендируют клетки в двух миллилитрах готовой среды. Возьмите колбу Т25 с тремя миллилитрами полной среды и добавьте в нее один миллилитр клеточной суспензии. Встряхните колбу крестообразно перед помещением ее в инкубатор. После 48 часов инкубации извлеките колбу из инкубатора и поставьте ее на чистую скамью. Выбросьте отработанную среду и трижды промойте прилегающую поверхность клетки одним миллилитром PBS, который содержит 1% пенициллина плюс стрептомицин. Затем добавьте пять миллилитров свежей, полной среды, и продолжайте инкубацию до тех пор, пока слияние клеток не превысит 90%. Промойте клетки трижды одним миллилитром PBS, содержащим 1% пенициллина стрептомицина. Затем инкубируйте клетки с одним миллилитром 0,25% раствора трипсина ЭДТА в течение одной минуты и 30 секунд. Теперь понаблюдайте за колбой под перевернутым микроскопом. Когда клетки появятся круглыми, отделяющимися и начнут плавать, добавьте в колбу два миллилитра полной питательной среды, чтобы завершить пищеварение. Затем с помощью пипетки отсадите клеточную суспензию и перенесите всю клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Промойте стенку колбы двумя миллилитрами PBS, содержащими 1% пенициллина стрептомицина, и добавьте его в ту же пробирку. Центрифугируйте пробирку при 878 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в соответствующем объеме полной среды. Наконец, проходите ячейки в соотношении один к двум или один к трем, в зависимости от необходимости. Второй пассаж клеток Мюллера или RMC сетчатки демонстрировал звездообразную или веретенообразную морфологию с круглыми или овальными ядрами и обильной цитоплазмой. Окрашивание гематоксилином и эозином выявило веретенообразные и звездообразные клетки с обильной розовой цитоплазмой и центрально расположенными овальными ядрами, соединенными между собой тонкими нитчатыми структурами. Иммунофлуоресцентное окрашивание RMC выявило сильную красную флуоресценцию в клетках, меченных глутаминсинтетазой и аквапорином-4, и ярко-зеленую флуоресценцию CRALBP, Kir4.1 и Vimentin. NeuN, отрицательный контроль не был обнаружен при иммунофлуоресцентном анализе, подтверждающем специфичность выделения RMC. Проточный цитометрический анализ показал, что 98,7% клеток были положительными на глутаминсинтетазу и 97% были положительными на CRALBP, что указывает на высокую чистоту RMC.