Матричная экстракция ДНК для целенаправленного секвенирования нового поколения на обеззараженных образцах мокроты

Наши исследования направлены на сокращение времени постановки диагноза ТБ и последующего начала лечения за счет внедрения NGS для персонализированного ухода за пациентами. Наш протокол оптимизирует TNGS для повседневного использования, решая вопросы интеграции рабочего процесса, стоимости и времени выполнения, с целью сокращения задержек диагностики и улучшения своевременного начала лечения.

Этот протокол позволяет проводить экономически эффективное, быстрое и качественное извлечение ДНК из клинических образцов в течение нескольких часов по сравнению с обычными методами CTAB, которые занимают до трех дней.

Наши результаты поднимают ключевые вопросы об интеграции TNGS в рутинную диагностику и оптимизации методов экстракции отрицательных мазков и скудных образцов для повышения чувствительности и клинической полезности. Мы изучим, можно ли использовать образцы остатков, полученных в ходе обычной диагностики, для последующего секвенирования, включая прямое полногеномное секвенирование мокроты, для оптимизации и расширения геномного надзора за туберкулезом.

[Рассказчик] Для начала получают термически обезвреженный осадок мокроты. Центрифугируйте образец при давлении 16 800 G, или на полной скорости в течение 15 минут. С помощью пипетки объемом от 20 до 200 микролитров аккуратно отсадите и выбросьте надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы гранула оставалась нетронутой. Аккуратно встряхните матричную суспензию для перемешивания, затем нанесите пипеткой 200 микролитров хорошо перемешанной матрицы для ресуспендирования гранулы. Переложите весь объем в пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 1,5 миллитра, содержащую три предварительно простерилизованные стеклянные бусины диаметром два миллиметра. Теперь поместите образцы в нагревательный блок при температуре 56 градусов Цельсия на 15 минут. После инкубации гомогенизируйте образцы с помощью вихря в течение 10 секунд для рассеивания клеток, затем инкубируйте образцы в нагревательном блоке при температуре 100 градусов Цельсия в течение 10 минут. Гомогенизация образцов с помощью высокоскоростного гомогенизатора с одним циклом в 60 секунд со скоростью 4,0 метра в секунду. Затем центрифугируйте суспензию при 12 000 G в течение пяти минут. Перенесите 130 микролитров ДНК-содержащей надосадочной жидкости в свежую 1,5-миллилитровую пробирку с низким связыванием, не нарушая гранулу. Выбросьте первую пробирку, содержащую матрикс и клеточный мусор. Чтобы очистить ДНК с помощью магнитных шариков, сначала сделайте бутылочку с магнитным шариком или подготовленную аликвоту тщательно пересуспендируйте бусины перед использованием, затем добавьте в 1,2 раза больше объема магнитных шариков к извлеченной ДНК, пипетируйте суспензию 10 раз, перемешайте образцы перед инкубацией при комнатной температуре в течение пяти минут. Поместите образцы на магнитный штатив объемом 1,5 миллилитра на три минуты или пока жидкость не станет прозрачной, затем осторожно отсадите и выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив шарики. С помощью трубок на магните добавьте 200 микролитров 80% этанола, чтобы шарики оставались нетронутыми. После 30-секундной инкубации тщательно отасуньте и выбросьте этанол, не потревожив гранулы. После второй промывки удалите остатки этанола с помощью пипетки объемом от одного до 10 микролитров. Оставьте трубки открытыми, чтобы шарики высохли на воздухе в течение 10 минут или пока они не приобретут матовый вид. Как только бусины приобретут матовый вид, снимите трубки с магнита и добавьте 50 микролитров воды, не содержащей нуклеаз, непосредственно на бусины в каждом образце. Затем смешайте каждый отдельный образец с помощью пипетирования 10 раз. Осмотрите трубку на предмет застрявших внутри бусин. После пятиминутной инкубации при комнатной температуре поместите пробирки обратно на магнитную решетку на три минуты или до тех пор, пока жидкость не станет прозрачной. С помощью пробирок на магнитной стойке перенесите содержащую ДНК надосадочную жидкость в четко обозначенную стерильную пробирку с низким связыванием. Концентрация ДНК была выше в образцах двухмиллилитровых отложений, по сравнению с 500 микролитрами во всех сортах мазка. Большая вариабельность выхода ДНК наблюдалась в образцах отложений объемом 500 микролитров. Глубина охвата прочтений секвенирования была выше в образцах осадочных пород объемом два миллилитра по сравнению с 500 микролитрами во всех сортах мазка. Вариабельность была выше в образцах с более чем мазком, извлеченных из осадка объемом 500 микролитров. Показатели приемлемости секвенирования, как правило, были выше в образцах объемом два миллилитра по сравнению с 500 микролитрами, с большей долей высоко приемлемых результатов. Образцы мазка третьего сорта плюс имели самую высокую долю приемлемых результатов по сравнению с образцами мазка первого плюса и второго плюса. В образцах объемом 500 микролитров было больше случаев, классифицированных как неприемлемые или не определенные.