В лицо Криосекция сетчатки мыши для многомерного пространственного молекулярного анализа

Сетчатка является полезной моделью для понимания нейронных вычислений. Эти вычисления зависят от специальных положений ячеек. Тем не менее, всеобъемлющие карты этого остаются неуловимыми.

За последнее десятилетие секвенирование одиночных клеток дало четкое описание типов клеток сетчатки. Теперь пространственная транскриптомика предлагает новый способ использования этих описаний в неповрежденных тканях. Критическая проблема использования пространственной транскриптомики заключается в том, что для нее требуются очень тонкие срезы ткани. Сетчатка уже довольно тонкая в горизонтальной плоскости, которая нас интересует.

Изобретая этот метод для создания тонких и быстрых участков, использовать пространственную транскриптомику в машинном обучении для картирования всех ганглиозных клеток сетчатки в одной ткани. За последние 30 лет только 17 из 45 ганглиозных клеток сетчатки мышей были картированы, и эта техника позволила нам картировать их все сразу.

[Инструктор] Для начала поместите усыпленную мышь на рабочий стол. Проводите височный полюс глазного яблока на роговице для сохранения ориентации и создания слабого места для диссекции. Погрузите шар и налейте раствор в посуду, содержащую лист фильтровальной бумаги. С помощью острых щипцов номер пять и ножниц по радужной оболочке осторожно удалите всю мускулатуру, фасции, сосуды и нервы из глазного яблока, не прокалывая склеру. Расположите кончик одного лезвия ножниц Iris перпендикулярно марке роговицы. Проколите глобус в этом положении. Сделайте один чистый разрез через роговицу и лимб, продолжая в склере и сетчатке по направлению к головке зрительного нерва. Затем расположите лезвие перпендикулярно первоначальному разрезу, примерно на один миллиметр позади лимба. Начните разрез радиально через склеры и сетчатку. Поддерживайте постоянную линию разреза сзади и параллельно лимбу, используя острые щипцы для направления и вращения глобуса. Если сетчатка и склера разделяются, переместите лезвие ножниц Iris, чтобы разрезать их вместе. Оцените заднее расстояние в один миллиметр с помощью средней ширины лезвия ножниц Iris После завершения радиального разреза параллельно лимбу осмотрите наличие оставшихся соединений сетчатки. Осторожно разрежьте их ножницами для радужной оболочки глаза, пока передняя и задняя части глазного яблока не будут разделены. Затем используйте две пары острых щипцов номер пять, чтобы аккуратно разделить переднюю и заднюю части глазного яблока. У старых мышей, если прозрачные волокна соединяют хрусталик с чашечкой сетчатки, осторожно разрежьте их ножницами с радужной оболочкой, минимизируя разделение склеральной сетчатки. Используя фильтровальную бумагу в качестве опорной платформы, разрежьте сетчатку в виде листа клевера, также называемого рисунком «железный крест» с помощью ножниц «Ирис». Повторите рассечение со вторым глазом. Отрежьте кончик одноразовой пластиковой пипетки для переноса, чтобы создать отверстие большего размера, чем рассеченная сетчатка и склера. Аккуратно отсосите сетчатку в пипетку и положите ее на предметное стекло микроскопа. С помощью лабораторной салфетки удалите излишки раствора для прицеливания до тех пор, пока сетчатка не перестанет плавать и ее можно будет сплющить. Теперь с помощью двух острых щипцов номер пять разверните сетчатку и расположите ее ровно внутренней чашкой глаза вверх. Сделайте рельефные надрезы длиной от 0,5 до двух миллиметров в каждом сегменте рельефа клевера, чтобы облегчить сплющивание, и отрегулируйте, чтобы предотвратить складывание. Удалите все остатки раствора для прицеливания, кроме жидкости, прилегающей к сетчатке. С помощью защитного накладки быстро нажмите и перенесите сетчатку так, чтобы наружная склера была обращена вверх, а внутренний наглазник соприкасался с покровным накладкой. Убедитесь, что сетчатка не сложена, и при необходимости внесите коррективы. Добавьте прицельный раствор, чтобы облегчить манипуляции, но удалите излишки салфеткой, чтобы предотвратить скручивание, и дайте высохнуть на воздухе в течение пяти-10 секунд. Теперь нанесите среду ОКТ, чтобы покрыть сетчатку. Затем с помощью щипцов равномерно распределите слой по покровному листу, чтобы предотвратить плавучесть. Мгновенная заморозка сетчатки в среде ОКТ осуществляется с помощью металлической пластины, охлаждаемой парами жидкого азота, или путем прямого контакта с сухим льдом. Храните замороженную сетчатку на сухом льду для немедленного использования. Для криосекции создайте купол ОКТ на патроне образца, занимающий внутренние два-три кольца при использовании одной и той же модели криостата. Выровняйте патрон для образцов горизонтально по отношению к режущей поверхности. Создайте или запишите руководство по ориентации, связывающее патрон со стадией криостата. Затем обрежьте купол, чтобы образовалась ровная поверхность, параллельная лезвию. С помощью бритвенного лезвия удалите излишки ОКТ латерально и аккуратно отделите сетчатку от покровного стекла, чтобы сделать ее подвижной. Снимите патрон со столика и нанесите небольшую каплю жидкого ОКТ на подготовленную плоскую поверхность ОКТ. Затем поместите сетчатку непосредственно на жидкий ОКТ. С помощью предварительно охлажденного предметного стекла нажмите и удерживайте сетчатку до тех пор, пока она не замерзнет. Нанесите больше ОКТ на сетчатку и патрон, чтобы обеспечить сцепление. Затем заморозьте сборку в зоне быстрой заморозки криостата. Для разрезания тщательно обрезайте излишки ОКТ до тех пор, пока не станет видна сетчатка. С помощью бритвенного лезвия придайте форму краям ОКТ-блока близко к сетчатке. Продолжайте обрезку, проверяя наличие склер. Когда склера будет видна, при необходимости отрегулируйте угол наклона сцены. Прекращайте обрезку, когда склеры будут примерно равномерно распределены по срезам. Теперь используйте предварительно охлажденные слайды и две кисти для рисования, чтобы манипулировать секциями и собирать их. Поместите палец под срез примерно на пять секунд, пока ОКТ не расплавится и не прилипнет ткань к предметному стеклу. Затем верните предметное стекло на холодную поверхность для повторного замораживания. Храните подготовленные горки на сухом льду для немедленного использования. Отчетливая иммунореактивность или RBPMS в слое ганглиозных клеток и четкое разделение сосудистых сплетений, меченных лектином томата, подтвердили успешное сохранение ламинации сетчатки и белковых маркеров. Мультиплексное детектирование РНК с помощью 12-плексной панели РНК Scope успешно сохранило пространственную структуру и выявило отчетливую экспрессию маркеров, таких как Grm6 и RBPMS, на срезе лица. Изображения с высоким разрешением подтвердили паттерны экспрессии одиночных клеток RBPMS и других маркеров, таких как Mafb6 и Meis2, подтвердив локализацию белка и РНК в слое ганглиозных клеток. Равномерное распределение сигнала по участкам листьев клевера и сильные сигналы в пространственных транскриптомных данных ксения подтвердили успешное высокопроизводительное профилирование и целостность РНК. Визуализация разрешения одной ячейки с использованием шаблонов ручного обнаружения, согласованных с ксением, подтверждает надежность протокола на всех платформах. Маркеры транскриптов, специфичные для типа клеток, показали стратифицированное ламинарное распределение в поперечном сечении сетчатки и на картировании лица, сохранили свое расположение по всей глубине. Детальное увеличение слоя ганглиозных клеток подтвердило точное обнаружение пространственного транскрипта относительно ядерного окрашивания DAPI.