Визуализация C. elegans с высоким разрешением на всех личиночных стадиях

В лаборатории мы работаем над всеми видами вопросов биологии развития. Сам я больше работаю над технической стороной дела, разрабатывая методы для лучшего решения этих вопросов с помощью методов визуализации. В области C. elegans успешно используется огромное количество методов, начиная от редактирования генов CRISPR, транскриптомики и протеомики и заканчивая микроскопией сверхвысокого разрешения. C. elegans — удивительная модель, однако в контексте наблюдения in vivo с высоким разрешением она сопряжена со своими проблемами, требующими иммобилизации для достижения наилучшего разрешения, что, в свою очередь, ограничивает жизнеспособность животных. Протокол представляет собой одно из возможных решений для долгосрочной визуализации C. elegans, что позволяет исследователям применять метод в своей собственной лаборатории и изучать широкий спектр динамических процессов развития непосредственно in vivo. В лабораторных условиях этот метод позволил детально наблюдать за формированием органов, например, в контексте морфогенеза или после деления соматических клеток во взрослом возрасте. С тех пор этот метод был принят многочисленными лабораториями, изучающими широкий спектр процессов развития.

[Ведущий] Для начала прикрепите прибор к опорной раме и закрепите его на вертикальном микроскопе. Наполните шприц деионизированной водой, затем прикрепите иглу 23-го калибра и длинный кусок трубки размером один на 16 дюймов с полым изогнутым стальным штифтом. Заполните трубку деионизированной водой из шприца и вставьте стальной штифт в пробитое отверстие входного отверстия клапана для подключения трубки. Извлеките шприц и иглу перед тем, как прикрепить трубку к соленоиду без чипа. Используя программное обеспечение для обработки изображений, включите соленоид и нагнетайте давление в устройстве в течение нескольких минут, чтобы вытеснить весь воздух из клапана. Проверьте завершение, визуально убедившись, что граница раздела воздух-вода темнеет и исчезает в материале PDMS. Выключите соленоид с помощью программного обеспечения для обработки изображений. Затем наполните одномиллилитровый шприц отфильтрованным бактериальным раствором и прикрепите к игле иглу 30-го калибра и длинный кусок трубки размером один на 32 дюйма. Нажмите на поршень, чтобы наполнить иглу и прикрепленную трубку раствором бактерий. Затем с помощью пинцета вставьте трубку с помощью 32-дюймовой трубки непосредственно во входное отверстие микрофлюидного устройства и поместите шприц на шприцевой насос. Нажмите на поршень шприца с помощью винта с накатанной головкой сзади, чтобы наполнить устройство жидкостью. Заблокируйте входное и выходное отверстия червяка герметичными стальными штифтами и надавите на него с помощью установочного винта, чтобы удалить оставшийся воздух из устройства. Затем снимите заблокированный стальной штифт на выходе и прикрепите контейнер для отходов к выпускному отверстию. Нажмите на шприц, чтобы убедиться, что контейнер для отходов правильно подключен и что в системе нет засоров. Извлеките второй заблокированный стальной штифт из входного отверстия и толкайте шприц до тех пор, пока на входе червяка не появится небольшая капля жидкости. Затем с помощью иглы 23-го калибра прикрепите более длинный кусок трубки размером один на 16 дюймов размером примерно от 15 до 20 сантиметров к одномиллилилитровому шприцу, наполненному S-базальным буфером. Прикрепите прямой стальной штифт 23-го калибра к другому концу трубки. Заполните иглу и трубку S-базальным буфером из шприца. Теперь вставьте стальной штифт на конце трубки в трубку, содержащую червяки, и протолкните небольшое количество жидкости через трубку, чтобы убедиться, что воздуха не осталось. Втяните червей в трубку, не втягивая их в шприц. Затем нажмите на шприц, подключенный к червям, до тех пор, пока на стальном штифте не появится небольшая капля жидкости, и вставьте стальной штифт в червячное отверстие микрофлюидного устройства. Поместите устройство на микроскоп с малым увеличением, 5x или 10x, или на микроскоп для препарирования. Расположите устройство таким образом, чтобы входное отверстие было видно с одной стороны поля зрения, а задняя часть входного отверстия канала ловушки была видна с другой стороны. Осторожно надавите на поршень шприца с червями. Затем подтолкните животных к массиву каналов. Как только животное повернется лицом к каналу, протолкните его в канал и повторите для других животных. Поймав достаточное количество животных, поместите шприц, все еще прикрепленный к входному отверстию червя, на предметный столик микроскопа, где он будет оставаться на протяжении всего эксперимента. Если нагрузка производилась на диссекционный микроскоп, перенесите прибор в микроскоп для визуализации. Теперь включите шприцевую помпу и запустите ее с заданной скоростью один микролитр в час на 0,5 микролитра. Запрограммируйте шприцевой насос таким образом, чтобы он работал со скоростью один микролитр в час в течение 0,5 микролитров, после чего скорость потока увеличивается на 100 микролитров в час для 0,5 микролитров, и схема потока повторяется на протяжении всего эксперимента. Поместите прибор на предметный столик микроскопа и убедитесь, что он надежно удерживается. Переключитесь на нужное увеличение изображения. Определите животных и области интереса в массиве каналов ловушек и настройте желаемые условия визуализации. Визуализируйте изображение в желаемых условиях визуализации, приводя в действие встроенный клапан через соленоид за 10 секунд до получения изображения, чтобы животные оставались на месте. Микрофлюидное устройство поддерживало высокое качество изображения в различных методах микроскопии, включая методы светлого поля, эпифлуоресценции, фокусного вращающегося диска и методы сверхвысокого разрешения благодаря использованию защитного стекла толщиной 170 микрометров. Развитие эпителиальных клеток Caenorhabditis elegans визуализируется от ранней L1 до середины личиночной стадии L2. Индукция первичных увядших клеток-предшественников вульвы и их последующее деление от поздней L1 до ранней личиночной стадии L4 была очевидна. Стадии формирования вульвы от начала L3 до взрослого возраста. Полученные изображения были улучшены за счет деконволюции и регистрации изображений, что улучшило визуальную четкость Видимые деления клеток происходили последовательно и своевременно у всех животных, причем все деления были завершены в пределах типичной продолжительности личиночной стадии. Длина гонад неуклонно увеличивалась на стадиях L2 и L3, при этом последовательные измерения обеспечивались благодаря прямому положению животных.