Улучшенная доставка и экспрессия генов с помощью внутрикостного введения наночастиц хитозана, инкапсулированных плазмид редактора адениновых оснований

Мы предлагаем метод генной терапии, который напрямую доставляет хитозан на основе аденина в костный мозг через внутрикостную инъекцию. Эффективность трансфекции экзогенных плазмид экспериментальным животным относительно низка, и введение плазмид для долгосрочной экспрессии генов может зависеть от иммунной системы. Мы используем хитозан для инкапсуляции плазмид на основе аденина и доставляем комплекс непосредственно в костный мозг мышей через внутрикостное введение, что делает его пригодным для заболеваний, вызванных аномальной функцией остеокластов.

Наш протокол обеспечивает высокую эффективность трансфекции, небольшие биологические повреждения и высокую эффективность экспрессии генов. Наша новая стратегия подходит не только для лечения заболеваний, вызванных аномальной функцией остеокластов, но и имеет значительный потенциал для развития в области генной терапии. Для начала поместите усыпленную мышь на рабочий стол.

С помощью хирургических ножниц и пинцета удалите большеберцовую кость и снимите всю окружающую мышечную ткань. Замочите очищенную голень в PBS и промойте до тех пор, пока не останется только кость. Наберите один миллилитр PBS в шприц и промойте клетки костного мозга с одного конца большеберцовой кости до тех пор, пока кость не станет полностью белой.

Далее соберите клеточную суспензию в пробирку. Центрифугируйте его при 800 G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. После пипетирования надосадочной жидкости добавьте в гранулу 500 микролитров буфера для лизиса эритроцитов.

Через минуту добавьте один миллилитр разделительного буфера, чтобы завершить лизис. Снова центрифугируйте суспензию при 800 G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость и положите полученную клеточную гранулу на лед для последующего использования.

Для трансфекции хитозана растворяют четыре миллиграмма хитозана в 20 миллилитрах раствора уксусной кислоты. Отрегулируйте pH до 5,5 с помощью 10 моляров гидроксида натрия. Затем распределите 500 микролитров раствора хитозана по отдельным микроцентрифужным пробиркам.

Теперь добавьте два, три, четыре и пять микрограммов плазмид ABE в отдельные пробирки. Растворите плазмиды в 500 микролитрах 30 миллимолярного сульфата натрия. Затем смешайте 500 микролитров раствора плазмиды с 500 микролитрами раствора хитозана в соответствующих пробирках.

Инкубируйте трубки на водяной бане при температуре от 50 до 55 градусов Цельсия в течение 15 минут. Сделайте каждую трубку вихревой в течение 15-30 секунд и дайте им постоять в течение 30 минут. Для определения характеристик проанализируйте диаметр и дзета-потенциал хитозана с помощью динамического рассеяния света.

Поддерживайте концентрацию хитозана на уровне 0,1 миллиграмм на миллилитр в дважды дистиллированной воде. Затем отлите образцы хитозана с концентрацией 0,1 миллиграмма на миллилитр на кремниевый чип. Добавьте 20 микролитров ресуспендированных образцов на сетки 200 меш и инкубируйте.

Центрифужную суспензию клеток костного мозга при 800 G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость, затем добавьте 500 микролитров лизата эритроцитов. Через минуту добавьте один миллилитр разделительного буфера, чтобы остановить реакцию.

Затем подсчитайте количество ячеек с помощью счетчика ячеек. Затем перенесите 1 миллион клеток в новую микроцентрифужную пробирку. После повторного центрифугирования извлеките надосадочную жидкость пипеткой и повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах PBS.

Перенесите ресуспензионные клетки в пробирку проточной цитометрии и измерьте эффективность трансфекции с помощью проточной цитометрии. Для инъекции в полость костного мозга зафиксировать обезболенную мышь в лежачем положении на операционном столе. Используйте клейкую ленту, чтобы зафиксировать переднюю конечность на месте.

Продезинфицируйте заднюю большеберцовую кость с помощью спиртового тампона. Затем загрузите плазмидный раствор в одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 26 калибра. Удалите все пузырьки воздуха и держите шприц готовым к инъекции.

Далее коснитесь и стабилизируйте голень мышки пальцами. Расположите иглу для инъекции так, чтобы она вошла в большеберцовый ствол от плато большеберцовой кости рядом с коленным суставом. Теперь поверните иглу параллельно большеберцовой кости, введите в полость костного мозга и медленно вводите в течение трех секунд.

После инъекции медленно извлекайте иглу в течение трех секунд. Немедленно продезинфицируйте место прокола с помощью спиртового тампона, чтобы остановить кровотечение. Поместите мышь в теплое место с температурой 37 градусов по Цельсию, чтобы облегчить ее восстановление.

Наночастицы, образованные плазмидами ABE и GRNA, имели однородную сферическую морфологию и узкое распределение по размерам со средним размером 202,9 нанометра. Дзета-потенциал равен 2,77 милливольта и индекс полидисперсии 0,22. Встроенная в хитозан плазмида ABE значительно усилила флуоресцентный сигнал в клетках костного мозга, что указывает на более высокую эффективность трансфекции по сравнению с контрольной группой.

Проточная цитометрия подтвердила, что плазмида ABE, кодируемая хитозаном, достигает высокой эффективности трансфекции в клетках костного мозга. При пиковой эффективности 51,2% наблюдалась при дозе четыре мкг, при этом три мкг обеспечивали баланс высокой эффективности 47,2%Секвенирование по Сэнгеру и ПЦР геномной ДНК клеток костного мозга выявили in vivo редактирование генов на целевом сайте А1 с эффективностью 14,27% и на сайте А2 с эффективностью 10,69%.