В естественных условиях Применение бесконтактного мечения на основе TurboID у Drosophila melanogaster

В этом исследовании бесконтактное мечение на основе TurboID используется для картирования взаимодействий белков кабачков в клетках зародышевой линии яичников дрозофилы. Были выявлены как хорошо известные, так и новые интеракторы кабачков. Примечательно, что было обнаружено, что несколько новых интеракторов участвуют в сворачивании белка, организации мембран и физическом трафике. В этом исследовании TurboID используется для эффективного мечения в тканях животных при одновременном контроле фонового биотинилирования. Специфичность мечения и охват белков повышаются за счет оптимизации контроля и обогащения биотинилированных пептидов после трипсинизации. Этот подход позволяет проводить системный скрининг белковых взаимодействий для выявления функций и молекулярных механизмов белков, представляющих интерес.

[Рассказчик] Для начала нанесите лабораторную ложку гладкой дрожжевой пасты, приготовленной путем растворения дрожжевого порошка в тройной дистиллированной воде, на стенку флакона. Возьмите еще один флакон с только что вылупившимися мухами и осторожно постучите по нему, чтобы собрать мух на дне. Переверните этот флакон на флакон с дрожжевой пастой и выровняйте края, чтобы мухи не сбежали. Постучите обоими флаконами друг о друга, чтобы перенести мух на нижнюю часть флакона, содержащего пасту. После завершения переноса надежно наденьте ватные колпачки на оба флакона и подождите три дня. На третьи сутки приготовьте 100 микролярный рабочий раствор биотина, разбавив один молярный запас биотина в трехкратной дистиллированной воде. Добавьте в раствор 500 микролитров 0,5% пропоновой кислоты. Смешайте раствор биотина с сухим дрожжевым порошком и перемешайте в пасту. Добавьте лабораторную ложку дрожжевой пасты с биотином на стенку пищевого флакона с биотином. Разделите мух на две группы. Переложите одну группу во флакон с обычным пищевым продуктом в качестве контроля. Переложите другую группу в пищевой флакон с биотином, дополненный дрожжевой пастой с биотином, чтобы начать подъем биотина. Через 16 часов переложите мух в новый флакон с обычной пищей. Для сбора яичников дрозофилы нанесите пипеткой один миллилитр холодного средства Grace's Insect Medium на чашку для вскрытия. С помощью щипцов с тонким кончиком поместите самку мухи в чашку для вскрытия и погрузите ее в среду. Удерживайте грудную клетку одной парой щипцов, не раздавливая тело. С помощью других щипцов аккуратно удалите кончик задней части живота, где расположены гениталии. Медленно выдавите яичники с помощью щипцов, начиная с верхней части живота и двигаясь вниз. Удалите мышечные сеточки и окружающие ткани, не повреждая яичники. Переложите чистые яичники в трубу объемом 1,7 миллилитра с помощью щипцов и держите трубу на льду. Для лизиса тканей добавьте 500 микролитров 2% додецилсульфата натрия в буферном физиологическом растворе, дополненном коктейлем ингибиторов протеазы, в трубку, содержащую яичники. Подождите, пока клетки лизируются и раствор станет липким. Выполните ультразвуковую обработку в условиях, показанных на экране. Далее, для осаждения ацетона, переложите лизат в пятимиллилитровую пробирку с низким связыванием. Добавьте холодный ацетон в пробирку в объеме, в шесть раз превышающем объем образца. Кратковременно перебейте трубку в вихрь, затем загрузите ее в мультивращатель и инкубируйте в течение ночи в течение примерно 16 часов при температуре минус 20 градусов Цельсия. Гранулируйте осажденные белки центрифугированием при 15 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Теперь добавьте два миллилитра смеси раствора, состоящего на 90% из холодного ацетона и 10% проб буферного физиологического раствора. Смешайте гранулу и раствор с помощью пипетирования вверх и вниз. Кратковременно перебейте трубку в вихрь, прежде чем снова загрузить ее в мультивращатель и инкубировать в течение двух часов при температуре минус 20 градусов Цельсия. Гранулируйте осажденные белки центрифугированием при 15 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. После сброса надосадочной жидкости выполните вращение при температуре четыре градуса Цельсия. Затем откройте трубку и дайте грануле высохнуть на воздухе в течение 10 минут. Повторно суспендируйте белковую гранулу в 500 микролитрах восьми моляров мочевины. Перелейте раствор в миллилитровую пробирку, содержащую адаптивную сфокусированную акустику или волокно AFA. Произведите ультразвуковую обработку трубки с использованием тех же параметров, что и ранее, прежде чем выполнять обработку бицинхониновой кислотой (BCASA) для определения концентрации белка. Денатурируйте белки с помощью термоблока, установленного на 450 об/мин в течение одного часа при 37 градусах Цельсия. Добавьте в пробирку пять микролитров одного молярного дитиотреита, растворенного в тройной дистиллированной воде, чтобы достичь конечной концентрации 10 миллимоляров. Снова поместите пробирку на термоблок на один час при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы уменьшить количество белков. Теперь добавьте 55 микролитров 400 миллимоларного раствора йодоацетамида в пробирку для образца до конечной концентрации 40 миллимоляров, прежде чем поместить пробирку обратно в термоблок для алкилирования. Разбавляют пробу добавлением 50 миллимолярного раствора бикарбоната аммония до тех пор, пока общий объем не достигнет четырех миллилитров. Добавьте четыре микролитра одного молярного раствора хлорида кальция в пробирку, чтобы достичь конечной концентрации в один миллимоляр. Проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы гомогенизировать раствор. Далее добавьте в пробирку 150 микролитров одного миллиграмм на миллилитр стокового раствора трипсина, поддерживая соотношение трипсина к образцу один к 20. Переваривайте белок с помощью термоблока, установленного на 450 об/мин, в течение 16 часов при 37 градусах Цельсия. Промойте 150 микролитров стрептавидиновых сопряженных магнитных шариков на три миллиграмма образца с одним миллилитром двух моляров мочевины в пробах буферного раствора. Нанесите пипеткой один миллилитр переваренных пептидов в пробирку с шариками и аккуратно перемешайте. Соедините смесь с оставшимся образцом пептида в пятимиллилитровой пробирке с низким связыванием. После инкубации в течение часа переложите один миллилитр смеси в 1,5-миллилитровую пробирку и поместите ее на магнитную решетку на одну минуту. Дважды промойте шарики одним миллилитром двух моляров мочевины в 50 миллимолярном бикарбонате аммония и один раз одним миллилитром тройной дистиллированной воды, прежде чем поместить трубку обратно на магнитную решетку еще на одну минуту и выбросить буфер. Затем нанесите пипеткой 100 микролитров элуцианского буфера в пробирку, содержащую шарики, осторожно перемешайте и элюируйте пептиды с помощью термоблока, установленного на 300 об/мин, в течение пяти минут при температуре 60 градусов Цельсия, прежде чем снова поместить пробирку на магнитный штатив. Теперь переложите элют в новую 1,5-миллилитровую трубку, избегая бусин. Теперь элюированный образец готов к сушке и использованию для масс-спектрометрического анализа. На этом рисунке представлена конфокальная визуализация и анализ протеомного взаимодействия кабачков V5 TurboID для идентификации проксимальных и взаимодействующих белков. Конфокальные изображения показали сильную перекрывающуюся экспрессию между трансгенами и проксимальными белками после кормления биотином, что было зафиксировано антителом V5 и стрептавидином, конъюгированным Alexa Fluer 594 соответственно. Анализ онтологии генов протеома кабачков V5 TurboID выявил обогащенные биотинилированные белки, участвующие в шапероновом опосредованном сворачивании белка, организации эндомембранной системы и регуляции транспорта от эндоплазматического ретикулума к аппарату GGI.