Ферментативная модификация и проточная цитометрия оценки белков, отображаемых на поверхности дрожжей

Это исследование сосредоточено на изучении химических модификаций белков, которые определяют поведение клеток. В этом случае цель состоит в том, чтобы понять предпочтения и кинетику ферментов, модифицирующих различные субстраты.

Впервые была продемонстрирована способность дефосфорилировать молекулу субстрата, отображаемую на поверхности дрожжей. Это открытие открывает возможности для обобщенного кинетического картирования ферментативных модификаций, которые ранее были недоступны. Это исследование направлено на решение проблем, связанных с пониманием взаимодействий ферментативного субстрата. Как правило, для этого типа оценки требуются клеточные лизаты или специализированные пептиды. В этом случае альтернатива FasL обеспечивается за счет использования дрожжевых субстратов.

Этот протокол продвигает традиционное отображение поверхности дрожжей в сторону анализа того, что обычно является внутриклеточными ферментативными реакциями во внеклеточном пространстве, что позволяет проводить FasL-анализ этих обычно трудно поддающихся оценке взаимодействий.

Этот протокол дает возможность опрашивать субстратные предпочтения различных ферментов с помощью высокопроизводительных методов и выполнять кинетические исследования с простым считыванием.

[Инструктор] Для начала разморозьте аликвоту подготовленных дрожжевых клеток на льду. Добавьте от 0,5 до 1,5 мкг плазмидной ДНК, содержащей дрожжевую конструкцию, непосредственно в клетки. Затем добавьте 0,5 миллилитра либо раствора для трансформации, либо стерильного 50% полиэтиленгликоля и 0,1 молярного раствора ацетата лития. Тщательно соедините смесь клеток, плазмидной ДНК и трансформационного раствора методом пипетирования. Статически инкубируйте смесь для трансформации в течение 30–60 минут при температуре 30 градусов Цельсия и делайте смесь вихревой смесью с интервалом в 15 минут. Соберите клетки путем центрифугирования при 1000G. Приготовьте 14-миллилитровую культуральную пробирку с 4,5 миллилитрами плазмидных дрожжевых клеток для роста клеток, или средой SDCAA. Повторно суспендируйте клетки, содержащие нужную плазмиду, в 500 микролитрах SDCAA и инокулируйте приготовленные 4,5 миллилитров среды. Аккуратно распределите 50 микролитров из пяти миллилитров инокулированной культуры на пластину SDCAA, не прокалывая шнек. Проводите статическую инкубацию при температуре 30 градусов Цельсия в течение 48 часов, чтобы определить эффективность трансформации. Теперь инкубируйте пять миллилитров клеточной культуры SDCAA в встряхивающем инкубаторе при температуре 30 градусов Цельсия и 300 оборотах в минуту в течение не менее 18 часов. Отслеживайте оптическую плотность на уровне 600 нанометров через 16 часов и повторите повторение через 20 часов. Как только образец достигнет оптической плотности, не превышающей шести, центрифугируйте культуру в течение трех минут при температуре 2500G и выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая дрожжевую гранулу. Повторно суспендируйте дрожжевую гранулу в среде индукции экспрессии белка (SRGCAA) до конечной оптической плотности на 600 нанометров меньше единицы. Инкубируйте дрожжевую культуру в встряхивающем инкубаторе при температуре 30 градусов Цельсия и 300 об/мин не менее восьми часов, но не дольше 24 часов. Затем измерьте оптическую плотность на 600 нанометрах, чтобы определить плотность ячеек. Подготовьте рабочий буфер для образцов, разбавив раствор рабочего буфера 2Х в соотношении один к двум с деионизированной водой в флаконе объемом 1,7 миллилитров. Добавьте соответствующий объем культуры дрожжей, необходимый для восстановления двух миллионов дрожжевых клеток, в флакон объемом 1,7 миллилитра для каждого образца. Центрифугируйте флакон в течение одной минуты при 4500G и с помощью микропипетки осторожно удалите надосадочную жидкость как биологически опасные отходы. Повторно суспендируйте гранулированные клетки в одном миллилитре PBSA перед повторным центрифугированием и удалением надосадочной жидкости. Отложите это в сторону. Приготовьте рекомбинантный человеческий раствор SHP-2 в конечной концентрации 1000 наномолей в общем объеме реакции 20 микролитров. Затем добавьте 7,7 миллиграмма DTT в 10 миллилитров деионизированной воды в конической трубке объемом 15 миллилитров, чтобы получить пятимиллимолярный раствор DTT. Теперь возьмите гранулированные клетки и повторно суспендируйте их в рабочем буфере так, чтобы итоговый объем реакции составил 20 микролитров на образец. Добавьте два микролитра пятимиллимолярного раствора DTT в каждый образец для получения конечной концентрации DTT 0,5 миллимоляра. Добавьте подготовленный объем SHP-2 к каждому образцу, чтобы достичь конечного объема в 20 микролитров, и аккуратно перемешайте с помощью микропипетки. Оберните крышки флаконов с образцами парапленкой, чтобы предотвратить утечку или перекрестное загрязнение. Инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов на роторе с постоянной скоростью. После извлечения образцов из ротора остановите реакцию, добавив по одному миллилитру PBSA в каждый образец перед тем, как снова центрифугировать их в течение одной минуты. Затем выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулированные образцы в 20-микролитровой смеси соответствующих первичных реагентов и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. Через 20 минут центрифугируйте образцы при 4500G в течение одной минуты и выбросьте надосадочную жидкость как биологически опасные отходы. Промойте клетки один раз, повторно суспензировав их в одном миллилитре PBSA, прежде чем снова центрифугировать клетки. Теперь повторно суспендируйте образцы в 20-микролитровой смеси соответствующих вторичных реагентов и инкубируйте в течение 15 минут в темноте. После центрифугирования образцов и удаления надосадочной жидкости еще раз промойте клетки PBSA, прежде чем снова центрифугировать. Затем повторно суспендируйте промытые образцы в 300-500 микролитрах PBSA, и перенесите их в пятимиллилитровые полистирольные пробирки для анализа проточной цитометрии. После подготовки цитометра нажмите «Файл», затем кнопку «Новый эксперимент», назовите эксперимент и нажмите «Сохранить», чтобы убедиться, что полученные данные сохраняются в нужном пути к файлу. Выберите значок точечной диаграммы на верхней панели инструментов, чтобы создать две или более точечных диаграмм для каждого образца. Для одной из точечных диаграмм убедитесь, что в имени оси X отображается канал FSCA, а в имени оси Y отображается канал SSCA. Для другого графика выберите имя по оси X, чтобы отобразить канал, в котором флуоресцирует вторичный реагент, нацеленный на антитело первичной антиэпитопной метки, и имя по оси Y, чтобы отобразить канал, в котором флуоресцирует вторичный реагент стрептавидина. Введите описательное имя образца, щелкнув правой кнопкой мыши по пробирке, выбрав «Редактировать имя» и введя имя образца. Поместите каждую пробирку с образцом в держатель цитометра и нажмите «Запустить», чтобы начать загрузку образца и сбор данных. При необходимости регулируйте события, время и скорость потока. Определите ворота, окружающие здоровые дрожжевые клетки, на графике сравнения SSCA и FSCA. Затем зарегистрируйте флуоресценцию всех контрольных образцов. Определите стратегию стробирования для созданного графика перед анализом обработанных образцов. Запишите флуоресценцию дефосфорилированных образцов с помощью цитометра и стратегии стробирования перед анализом данных с помощью программного обеспечения для проточной цитометрии. Оцените фосфорилирование путем измерения и сравнения медианы по оси Y клеток, экспрессирующих белок на своей поверхности, и исходного уровня фосфорилирования, обеспечиваемого неиграющими клетками между образцами и контрольной группой. Наконец, рассчитайте разницу в процентах медианного фосфорилирования, используя предоставленную формулу. Влияние различных концентраций фосфатазы SHP-2 и времени инкубации на медианную разницу фосфорилирования в поверхностных субстратах дрожжей проиллюстрировано на этом рисунке. Процентная медианная разница фосфорилирования уменьшалась с течением времени при всех концентрациях SHP-2, при этом наибольшее дефосфорилирование наблюдалось при концентрации 1000 наномоляров SHP-2 в течение четырех часов». После двух часов инкубации 1000 наномоляров SHP-2 привели к примерно 48,8% медианной разнице фосфорилирования, что значительно ниже, чем 750 наномоляров в тот же момент времени. Не наблюдалось существенной разницы в медиане фосфорилирования при удлинении инкубации с двух до трех часов в концентрациях 500 наномоляров, 750 наномоляров и 1000 наномоляров SHP-2.