Рабочий процесс с использованием криогенного совпадающего флуоресцентного, электронного и ионного микроскопа для прицельного фрезерования ячеек

Мои исследования разрабатывают методы оптической микроскопии для сохранения клеточных особенностей криогенных ламелл во время сфокусированного ионного измельчения, что позволяет провести детальный анализ с помощью криогенной электронной томографии для выявления естественной биологической организации. Оптическая микроскопия интегрирована в системы CryoFIB-SEM, но редко находится в том же положении, что и FIB. Это требует регистрационных методов для сохранения флуоресцентно маркированных мишень в конечной ламелле.

Для начала охладите передаточную станцию вручную с использованием жидкого азота, когда ступень достигнет криогенных температур. Загрузите одну обрезанную автосетку в кассету образцов, предназначенную для системы криогенной световой микроскопии. Убедитесь, что автосетка расположена между склеенной крышкой и прокладкой.

Затяните кольцевой винт, чтобы закрыть кассету, и вставьте её в паз на станции передачи. Подключите передающую станцию к криогенной световой микроскопии. Используйте внутреннюю камеру, чтобы направить кассету с образцом на этап сэмпла.

В программном обеспечении для световой микроскопии переместите ступень образца из положения загрузки в заранее определённое положение трёх лучей. В программном обеспечении FIB-SEM установите увеличение на 100X и нажмите на левое окно в верхнем углу. Во вкладке выравнивания программы световой микроскопии нажмите на Z и выберите функцию воспроизведения, чтобы получить атлас сетки SEM.

Определите квадратную область с разбитой углеродной пленкой и дважды кликните, чтобы переместить этап образца в это место. Вернуться к программному интерфейсу. Активируйте FIB и получите изображение.

Регулируйте увеличение с помощью выпадающего меню в левом верхнем углу. Нажмите Play, чтобы отобразить изображение FIB. Затем задайте размер шага с помощью планки слайда.

Теперь нажмите Z и Z, чтобы отрегулировать положение стадии Z, пока горизонтальная линия, присутствующая в ионе, и изображения электронов не совпадут с одной и той же особенностью. Выберите вкладку SEM в программе световой микроскопии. Используйте кнопки OR X и Y, чтобы выровнять общую особенность между изображениями SEM и Ion.

Теперь включите флуоресцентный микроскоп. Выберите вкладку FLM, установите условия изображения отраженного света и выберите Воспроизведение. Затем выровняйте отраженное изображение света с изображением SEM.

Увеличите изображение и нажмите кнопку прямоугольника, чтобы определить схему фрезера для ионного пучка. Нажмите Start Patterning на дисплее 2, чтобы фрезеровать небольшой узор с использованием сфокусированного ионного пучка. Подтвердите, что фрезерный узор виден как в сфокусированном ионном пучке, так и в люминесцентном микроскопе.

В программном обеспечении для световой микроскопии переходите на вкладку «Локализация» и активируйте соответствующие условия для настройки люминесцентных каналов. Назначьте каждому флуорофору отдельный канал и добавьте дополнительный канал для яркого поля. Отрегулировать питание светодиодов и время экспозиции для каждого люминесцентного канала, чтобы определить интересующую цель.

Когда параметры будут удовлетворительны, получите предварительно фрезерную флуоресцентную z-стеку, проходя по осевому направлению. Затем отметьте цель как область интереса. Переключитесь на программное обеспечение FIB-SEM и нарисуйте ламеллу в интересующей области.

Проведите грубую фрезерную обработку для удаления насыпного материала, держа флуоресцентный микроскоп включённым для мониторинга изменений сигнала. Откройте интерферометрический набор инструментов на базе Python с терминала, чтобы отслеживать флуоресцентный сигнал во время истончения ламелли. Уменьшите ROI примерно до двух микрометров с помощью режима поперечного сечения очистки.

Для цели с осевым протяжением более 300 нанометров в графическом интерфейсе Python выберите цель в флуоресцентной микрофотографии. Программа автоматически начнёт отображать яркость в зависимости от времени с каждым новым кадром. Отслеживайте интенсивность флуоресценции с помощью набора инструментов Python.

Промольте образец в режиме очистки поперечного сечения, чтобы удалить оставшуюся опорную плёнку ниже интересующей области. Обратите внимание на резкие падения интенсивности флуоресценции как сигналы для смены направления фрезера. Если при перемоле снизу вверх наблюдается резкое снижение, прекратите и начните перемол сверху вниз.

После завершения фрезера сверху вниз завершайте ламеллу, фрезеруя снизу вверх в режиме поперечного сечения до достижения желаемой толщины. Затем сделайте изображение ламелли после перемола с флуоресценцией. Перенесите образец в CryoTEM.

Загрузите многоканальное флуоресцентное изображение после обработки и проекционное изображение CryoTEM в программное обеспечение для проективного преобразования для регистрации интересуемых регионов. Теперь выберите от восьми до десяти пар точек отсчёта, видимых как на флуоресцентных, так и на электронных микроскопических изображениях, чтобы вычислить проективное преобразование. Используйте наложенное изображение как ориентир для выбора области изображения.

Затем выберите подходящие параметры увеличения и захвата для серии наклона в зависимости от размера целевой конструкции и желаемого разрешения. Дифференцированные макрофагные клетки, помеченные SiR-Tubulin, имели один яркий флуоресцентный пунктум диаметром примерно один микрометр, соответствующий MTOC, а также фиброподобные структуры, расходящиеся к периферии клеток, соответствующие сети микротрубочков. Когда образец был обработан толщиной примерно 800 нанометров, уникальный флуоресцентный MTOC пунктум разделился на две отдельные пятнышки, каждая примерно 700 нанометров в диаметре.

Интенсивность флуоресценции увеличивалась после удаления нефлуоресцентного массового материала и поглощающей опорной плёнки, за которой следовало резкое снижение при дальнейшем истончении ламелли с двух микрометров до менее 200 нанометров. Коррелированная криогенная флуоресцентная и электронная микроскопия позволила точно нацеливать структуры во время фрезера. Реконструированные томограммы и сегментированные модели показывают, что центриоли состоят из микротрубочков-триплетов.

В случаях, когда в конечной ламелле сохранялась только одна флуоресцентная точка, на соответствующей томографии визуализировала одна центриоль. Точность флуоресценции на основе миллимиллинга ограничена методами регистрации, которые сильно страдают от разрешения с ограничением дифракции, несоответствия показателей преломления и движения, вызванного фрезером. Одновременная оптическая микроскопия и FIB-фрезер устраняют ошибки регистрации, используя обратную связь в реальном времени от флуоресцентной микроскопии для управления процессом фрезера.

Это позволяет избежать ошибок, вызванных несоответствием дифракционного предела и показателя преломления, что позволяет проводить точное помилование, сохраняющее флуоресцентно маркированные структуры для криоэлектронной томографии внутри конечной ламелли. Наши исследования позволяют увидеть клеточные структуры, которые ранее было сложно напрямую визуализировать с помощью криоЭТ, проливая свет на молекулярные механизмы, лежащие в основе широкого спектра ключевых микромолекулярных машин.