Синтез сложных гигантских униламеллярных везикул: биомиметическая модель нуклеатных клеток

В данной статье представлен метод получения сложных гигантских униламеллярных везикул (цГУВ) со структурой везикул в везикуле, с настраиваемой электропроводностью во внутренней, кольцевой и внешней областях. Электрообразование синтезирует простые GUVs, которые превращаются в стоматоциты и цGUVs посредством осмотического шока, обеспечивая ценную модель для изучения биофизики ядросодержащих клеток.

Мы провели тщательное исследование синтеза и электрогидродинамики сложных гигантских униламеллярных везикул, чтобы установить их в качестве биомагнитных эквивалентов эукариотических клеток. Попытка заключается в понимании технологий, включающих применение электрического поля к биологическим клеткам, таких как электропорация клеток и электродеформация клеток.

Для продвижения исследований в этой области используется сочетание флуоресцентной и световой микроскопии, наносекундной импульсной электротерапии, осциллографа и источников питания, а также инновационных методов синтеза. Сложность синтеза хорошо сформированных соединений ГУВ заключается в чувствительности метода к температуре, типам липидов и используемому составу. В данной работе мы демонстрируем это для DMPC и холестериновой системы, но обобщение остается сложной задачей. В литературе синтезированы простые GUV, имитирующие нуклеиновые клетки. Мы синтезируем сложный гигантский везикул для эмуляции ядросодержащих клеток с защитной структурой клапана, заключающей в себе внутреннюю везикулу размером примерно в половину размера наружного везикулы.

Мы сосредоточимся на изучении влияния микро- и наносекундных импульсов на внутренний пузырьок, который является мимиком для ядра биологической клетки в условиях электропорации.

[Рассказчик] Для начала тщательно очистите предметные стекла с оксидом индия и олова или покрытием ITO, используя раствор для мытья посуды, и промойте деионизированной водой с проводимостью 0,055 микросименса на сантиметр. Затем с помощью 100% раствора этанола снова очистите предметные стекла и промойте деионизированной водой. Сушите горки в духовке, установленной при температуре 85 градусов Цельсия. Определите проводящую сторону каждого предметного стекла с покрытием ИТО с помощью токоизмерительных клещей. Закрепите чистое салазку на столике спин-кодера с помощью пылесоса, следя за тем, чтобы проводящая сторона была обращена вверх. Нанесите 25 микролитров липидного раствора, одну – четыре капли на проводящую сторону одного предметного стекла ITO. Возьмите еще одну горку и нанесите 25 микролитров липидного раствора два таким же образом. Высушите в вакууме оба предметных стекла с липидным покрытием в эксикаторе и храните в темноте не менее двух часов. Затем расположите липидную горку ITO с липидной накидкой параллельно чистой горке, следя за тем, чтобы проводящие стороны были обращены друг к другу, и поместите между ними распорку из силиконовой резины толщиной три миллиметра. Запечатайте установку струбциной, чтобы создать камеру электроформования. Теперь заполните камеру 100-миллимолярным раствором сахарозы с помощью двухмиллилитрового шприца. Подключите выходной кабель функционального генератора к слайдам с покрытием ITO с помощью функционального генератора. Поместите обе камеры электрообразования в инкубатор, поддерживаемый при температуре от 38 до 40 градусов Цельсия. Подайте электрическое поле переменного тока в пять вольт в размахе на частоте 10 Гц с помощью двухканального функционального генератора в течение четырех часов. После инкубации отсоедините камеры электрообразования от генератора функций. Достаньте их из инкубатора и дайте им остыть до комнатной температуры. С помощью шприца соберите синтезированные гигантские униламеллярные везикулы из каждой камеры и перенесите их в отдельные двухмиллилитровые микроцентрифужные пробирки. Инкубируйте пробирки при комнатной температуре от 25 до 27 градусов Цельсия в течение одного часа, прежде чем приступать к осмотическому шоку. Перенесите 200 микролитров простых гигантских униламеллярных везикул, или sGUVs, взвешенных в гидратирующей среде, содержащей 100-миллимолярный раствор сахарозы, в камеру наблюдения и введите 125 микролитров 300-миллимолярного раствора глюкозы, чтобы вызвать осмотический шок и инициировать изменения формы. Дайте СГУВ, которые в настоящее время подвергаются осмотическому шоку, отдохнуть в течение одного часа внутри камеры наблюдения, расположенной на предметном столике для микроскопии. Проводите дифференциальную, интерференционную, контрастную и эпифлуоресцентную микроскопию с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного монохроматической камерой. Используйте объективы Plan Fluor со сверхдлинным рабочим расстоянием 20X на 0,45 и 40X на 0,60 для наблюдения за переходами формы в sGUV. Для эпифлуоресценции используйте набор зеленых фильтров с возбуждением на 510–560 нанометрах, дихроичное зеркало на 575 нанометров и барьерный фильтр на 590 нанометров для бислоев, окрашенных в красный цвет Найла. Отслеживайте переходы формы в камере наблюдения с помощью дифференциальной, интерференционной, контрастной и эпифлуоресцентной микроскопии с объективами Plan Fluor. Наблюдайте за формированием устьицкоцитарных пузырьков по мере того, как протекает переход формы. Сначала следите за тем, как оседают более крупные пузырьки, а затем со временем увеличивайте количество более мелких пузырьков. Затем добавьте раствор соли для регулировки проводимости в различных областях цГУВ перед индуцированием осмотического шока. Например, чтобы создать более высокую проводимость во внешней и внутренней областях, чем в кольцевой области, перенесите 200 микролитров раствора сахарозы в камеру электрофузии. Добавьте в камеру 20 микролитров 7,5-миллимолярного раствора соли и вызовите осмотический шок 125 микролитрами 300-миллимолярного раствора глюкозы. Дайте осмотическим ударным sGUV отдохнуть в камере в течение трех-четырех часов. Подтвердите, что полученные цГУВ имеют более высокую проводимость во внешней и внутренней областях по сравнению с кольцевой областью. Чтобы выполнить электродеформацию цГУВ, расположите проволочные электроды на расстоянии 500 микрометров друг от друга и подайте электрический потенциал переменного тока 7,5 вольт от размаха до пика на частоте 100 килогерц с помощью функционального генератора. После приложения электрического поля захватите видео с частотой 10 кадров в секунду и наблюдайте за сплюснутой деформацией наружных везикул и пролонгированной деформацией внутренних пузырьков. Затем загрузите смесь cGUV в полость, задвижку и запечатайте крышкой для предотвращения движения. Используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп для анализа морфологии cGUV с помощью сканирования по оси Z с шагом в один микрометр. Для визуализации используйте объектив Plan Apochromat 40X by 1.3 oil DIC. Используйте красный одноканальный режим с возбуждением 561 нм и излучением от 561 до 695 нм для изображения cGUV, окрашенного Niall Red или Rhodamine PE. Измените и извлеките файл . CZI с помощью программного обеспечения, связанного с микроскопом. Вставляйте графические элементы, такие как масштабные линейки, и включайте 2D и 3D виды. Затем перейдите к методу обработки и параметрам, чтобы настроить нужные настройки. Затем нажмите «Применить», чтобы экспортировать изображение в формате JPG. Наконец, откройте файл в программе ImageJ. Чтобы вставить масштабную линейку, перейдите в раздел «Анализ», затем установите масштаб для калибровки, затем выберите «Анализ», а затем «Инструменты» и «Масштабная линейка», чтобы применить ее. Конфокальная визуализация Z-стека подтвердила, что внутренние везикулы были полностью отделены от внешних везикул и повышены в плоскости Z из-за более низкой плотности внутреннего раствора. Промежуточное состояние стоматоцитов показало узкую шейку, соединяющую внутренние и внешние везикулы до полного разделения. Разнообразная популяция везикулярных форм, включая множественные внутренние везикулы, звездообразные тела и трубчатые структуры, наблюдалась через шесть часов после осмотического шока. Высокое содержание цГУВ формировали с использованием липидной смеси 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолина и холестерина в молярном соотношении 63 на 37. Под действием электрического поля переменного тока цГУВ деформировались, при этом внешние везикулы образовывали сплюснутую форму, а внутренние везикулы образовывали вытянутую форму.