Мышиная модель стеатозного заболевания печени, ассоциированного с метаболической дисфункцией, с фиброзом

В наших исследованиях мы сосредоточены на стеатозном заболевании печени, связанном с метаболической дисфункцией (MASLD), а также на механизмах накопления липидов и фиброза. Некоторые из последних достижений включают транскриптомику отдельных клеток и специальных клеток, стандартизацию животных моделей MASLD и одобрение семаглутида для лечения MASLD. Существует множество животных моделей MASLD, но мы выяснили, что многие из них не вызывают фиброз печени.

Чтобы решить этот вопрос, мы разработали нашу мышечную модель MASLD. Наша мышиная модель вызывает MASLD с фиброзом, кормя гиперфагических мышей рационом, похожим на средний американский рацион. Это вызывает MASLD, очень похожий на заболевание у людей.

Наш метод облегчит изучение патофизиологии MASLD и тестирование новых методов терапии. Для начала возьмите на стекло срез печененной ткани с парафином. Для депарафинизации погрузите затвор в ксилол или цитрисольв на пять–пятнадцать минут.

Затем последовательно увлажняйте участок 100, 95 и 70% этанола, затем по пять минут в каждую дистиллированную воду. Затем покрасьте участок Sirius Red и обезвожьте стекло. Снимайте по одному слайду из раствора для очистки и промокните их бумажным полотенцем, чтобы удалить лишнюю жидкость.

Добавьте примерно 50–100 микролитров монтажного материала в секцию. Накройте участок крышкой и аккуратно прижмите её, чтобы убрать пузырьки воздуха. Дайте горке высохнуть на воздухе.

Теперь наблюдайте подготовленный участок под световым микроскопом с ярким освещением с помощью объективов от 4 до 20 раз. Переведите примерно 500–1000 микролитров гомогената печени в центрифугные трубки объемом 1,5 миллилитра и добавьте трихлоруксусную кислоту для достижения конечной концентрации 12%. Кратковременно втяните трубку в трубку для смешивания содержимого. Инкубировать трубку в ледяной водяной бане 30 минут и центрифугировать при 6 000 г при 4 градусах Цельсия в течение 10 минут.

Затем снимите супернатант пипеткой. Добавьте один миллилитр 100% ледяного этанола, чтобы промыть гранулу, и соникизуйте для тщательной суспензии. После повторного центрифугирования подвески аспирируете супернатант.

После третьей промывки держите трубку открытой, чтобы пеллеты сушили на воздухе 10 минут или дольше, если это необходимо. Затем добавьте 800 микролитров 6 нормальной соляной кислоты в трубку с белковой гранулой и повторно суспензируйте гранулу с помощью соникатора, как показано ранее. Перенесите подвеску в стеклянную трубку или флакон с винтовой крышкой и плотно запечатайте крышку.

Инкубировать трубку в духовке при 110 градусах Цельсия примерно 22 часа. При необходимости перенесите содержимое стеклянного флакона в центрифугу перед вращением. Центрифугуйте гидролизованный образец при 16 000 г в течение 10 минут и аспирируйте супернатант с гидроксипролином в пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Для окисления гидроксипролином добавьте 450 микролитров раствора хлорамина в пробирки с 50 микролитрами образца и стандартов. Смешайте содержимое в трубках с помощью вихря и инкубуйте при комнатной температуре в течение 25 минут. Затем добавьте 500 микролитров реагента Эрлиха в каждый образец и стандарт.

После вихря инкубировать образцы при 65 градусах Цельсия в течение 20 минут в инкубаторе. После инкубации дайте трубкам остыть до комнатной температуры и наблюдайте за итоговым цветом образцов. Наконец, измерьте поглощение образцов и стандартов с помощью спектрофотометра на длине волны 550 нанометров.

Окрашивание тканей печени с помощью Picro Sirius Red при ярком освещении поля показало коллагеновый красный цвет на светло-оранжевом или жёлтом фоне. Отложение коллагена, соответствующее фиброзу, окрашивалось, а также коллаген в стенках кровеносных сосудов, гилюме и капсуле печени. Поляризованная световая микроскопия выявила характерные двупреломлённые коллагенные волокна на тёмном фоне, что улучшило визуализацию фиброза.

Количественная оценка положительной области коллагена печени у желтых мышей агути, питавшихся диетой с высоким содержанием жиров и фруктозы (HFFD), показала значительно более высокий уровень фиброза по сравнению с дикими контрольными мышами, питавшимися низкожировыми и фруктозными диетами. Количественная оценка содержания гидроксипролина в печени показала значительно более высокий уровень у желтых мышей агути, питавшихся диетой HFFD, по сравнению с контрольными мышами спустя 16 недель на диете, что подтвердило увеличение отложения коллагена в фиброзной печени.