Методика биопсии конъюнктивы и прямой иммунофлюоресценции для диагностики пемфигоида слизистой оболочки
17 июня 2025 г.
Здесь мы представляем протокол забора и обработки биопсии конъюнктивы для выявления пемфигоида слизистой оболочки.
Мы пытаемся увеличить использование биопсии конъюнктивы для диагностики пемфигоида слизистой оболочки, который является хроническим рубцовым конъюнктивитом, и при отсутствии лечения может привести к слепоте. Прямое иммунофлюоресцентное окрашивание биопсии конъюнктивы для отложения иммунного комплекса в мембране пациента является диагностическим методом ММП, но не проводится во многих центрах по всему миру. В данной методике описаны приемы забора биопсии конъюнктивы и использование оптимальной температуры среза среды, заполненной картриджами для переноса проб и подготовки крови, что сокращает трудоемкость работы с образцом.
Для начала запланируйте биопсию обоих глаз пациента с подозрением на пемфигоид под местной или местной анестезией с использованием операционного микроскопа. Получите информированное согласие пациента и четко объясните возможные побочные эффекты, включая кровотечение, рубцевание и потенциальную необходимость начала приема местных стероидов после операции. Перед взятием биопсии подготовьте картриджи, очистив их обычным физиологическим раствором и заполнив оптимальной температурой разреза, или средой ОКТ отдельно для каждого глаза.
Теперь поместите зеркало в выбранный глаз, правый или левый. После местного применения пропаракаина, если пациент все еще испытывает боль, введите 0,2 миллилитра 2%-ного лидокаина субконъюнктивально с помощью 1 миллилитра туберкулинового шприца. После поднятия конъюнктивы со склеры с помощью щипцов конечностей выполните линейное иссечение размером примерно 4-5 миллиметров в длину и 2-3 миллиметра в ширину с помощью ножниц Уэсткотта.
Немедленно перенесите всю биопсию в среду с оптимальной температурой резки. Заморозьте внедренные образцы с помощью жидкого азота или сухого льда. Затем храните их при температуре 80 градусов Цельсия в течение ночи.
Разрежьте замороженную ткань на ломтики толщиной 4-6 микрометров с помощью криостата, поддерживаемого при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия. Установите срезы на положительно заряженные предметные стекла микроскопа с полилизиновым покрытием, чтобы обеспечить адгезию. Затем заверните горки в алюминиевую фольгу перед хранением при температуре 80 градусов Цельсия до окрашивания.
Разморозьте горки при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем зафиксируйте ткань в 100% холодном ацетоне еще на 10 минут, чтобы сохранить антигены и свести к минимуму повреждение тканей. Теперь промойте предметные стекла с помощью OBS три раза, каждый в течение пяти минут, чтобы удалить остаточную среду ОКТ и ацетон.
Нанесите на предметные стекла разведенные конъюгированные антитела, анти-IgG, анти-IgA, анти-IgM и анти-IgC3. Не применяйте антитела для предметного стекла отрицательного контроля. Теперь выдержите предметные стекла во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 45-60 минут.
Затем промойте предметные стекла PBS три раза по пять минут каждый, чтобы удалить несвязанные антитела. Противоморочное покрытие монтажной средой, содержащей DAPI для ядерной визуализации. Наконец, наденьте на каждую горку защитную пластину и дайте им застыть в течение 20 минут.
Изучите предметные стекла с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного соответствующими фильтрами, в том числе зеленым фильтром возбуждения на 488 нанометрах для обнаружения флуорофора. Базальная мембрана была подтверждена при биопсии конъюнктивы с использованием окрашивания PAS, проявляясь в виде непрерывной ярко-розовой полосы у основания эпителия. Прямая иммунофлуоресцентная положительность визуализировалась в виде ярко-зеленой флуоресценции вдоль базальной мембраны.
Прямые иммунофлуоресцентные положительные биопсии показали флуоресценцию иммуноглобулинов IgM, IgA и IgG, в то время как отрицательные биопсии отсутствовали флуоресцентно. Положительный контроль показал сильную зеленую флуоресценцию на базальной мембране.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол забора и обработки биоптата конъюнктивы для диагностики слизисто-пемфигоидного заболевания (СПЗ) — серьезного состояния, которое при отсутствии лечения может привести к слепоте.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Офтальмология
- Патология
- Иммунология
Теоретические сведения
- Слизисто-пемфигоид — это хронический рубцующий конъюнктивит.
- Прямая иммунофлуоресцентная окраска имеет решающее значение для диагностики.
- Во многих центрах биопсия конъюнктивы при слизисто-пемфигоиде не проводится.
- Нелеченый слизисто-пемфигоид может привести к тяжелым осложнениям, включая слепоту.
Цель исследования
- Способствовать более широкому применению конъюнктивальной биопсии для диагностики MMP.
- Представить подробный протокол процедуры биопсии.
- Подчеркнуть важность точной диагностики для предотвращения слепоты.
Используемые методы
- Спланируйте проведение биопсии обоих глаз под воздействием местной или топической анестезии.
- Получите от пациента информированное согласие с описанием возможных рисков.
- Подготовьте картриджи со срезочной средой OCT (optimal cutting temperature).
- Для обеспечения точности в ходе биопсии используйте операционный микроскоп.
Основные результаты
- Данный протокол обеспечивает эффективную обработку и подготовку образцов.
- Метод прямой иммунофлуоресцентного окрашивания позволяет подтвердить диагноз MMP.
- Информированное согласие гарантирует осведомленность пациента о возможных побочных эффектах.
- Совершенствование методов может способствовать более широкому применению биопсии.
Выводы
- Биопсия конъюнктивы необходима для диагностики pemphigoid слизистых оболочек.
- Стандартизированные протоколы позволяют повысить точность диагностики.
- Более широкое применение этого метода может предотвратить слепоту у пациентов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Прямая иммунофлуоресценция (ПИФ) биоптата конъюнктивы является определяющим диагностическим инструментом при слизисто-пемфигоидном заболевании (СПЗ) — патологии с высокой степенью неудовлетворенной медицинской потребности из-за риска необратимой слепоты. Стандартизированные протоколы биопсии и ПИФ обеспечивают надежное обнаружение иммунных комплексов, что способствует раннему вмешательству и снижает диагностическую неопределенность в офтальмологических и иммунопатологических исследованиях. Внедрение этих методов повышает прогностическую уверенность в критической точке диагностики, что позволяет определять дальнейшие терапевтические стратегии и приоритизировать портфель лечебных мероприятий.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает точную идентификацию иммуноопосредованной патологии посредством прямого выявления депозитов иммуноглобулинов и компонентов комплемента.
- Способствует снижению неопределенности в понимании механизмов заболевания, позволяя отличить мембранопорозный pemphigoid (MMP) от лекарственно-индуцированных этиологий или псевдоpemphigoid.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней для патологических процессов, обусловленных иммунными комплексами.
Скрининг и разработка методов анализа
- Позволяет создать валидированные методы иммунофлуоресцентного анализа тканей для воспроизводимого обнаружения биомаркеров заболеваний.
- Стандартизирует правила обращения с образцами и их обработку, что повышает надежность анализа и сопоставимость результатов между различными центрами.
- Обеспечивает количественную и качественную оценку локализации иммунных комплексов на базальной мембране.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит диагностические результаты в соответствие со стратегиями трансляционных биомаркеров для аутоиммунных заболеваний глаз.
- Обеспечивает преемственность от клинической диагностики до валидации иммуноопосредованных механизмов в доклинических моделях.
- Поддерживает продвижение кандидатов в иммуномодулирующие терапевтические средства с учетом оценки рисков.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный протокол проведения биопсии и DIF (прямой иммунофлуоресценции) объединяет диагностический и исследовательский этапы, обеспечивая информационную поддержку как клинических, так и доклинических исследовательских циклов.
- Биология открытий: предоставляет прямые доказательства участия иммунных комплексов, разъясняя механизмы заболевания и поддерживая проверку гипотез.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые методы иммунофлуоресцентного анализа для обнаружения биомаркеров в образцах тканей.
- Аналитика: позволяет получать количественные показатели флуоресценции для сравнительного анализа образцов пациентов и контрольных групп.
- Трансляционные исследования: связывают результаты клинической диагностики с разработкой доклинических моделей и валидацией биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: предлагает воспроизводимый протокол обнаружения иммунных комплексов для различных контекстов аутоиммунных и воспалительных заболеваний тканей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при диагностике иммуноопосредованных заболеваний и валидации мишеней.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов иммунофлуоресцентного анализа тканей.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработок и снижает неопределенность диагностики на поздних этапах.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию иммуномодулирующих и противовоспалительных терапевтических программ с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с тканями глаза и методами иммунофлуоресцентной микроскопии.
- Необходим доступ к криостату для получения срезов, флуоресцентному микроскопу и валидированным антителам.
- Требуется межкомандная стандартизация выбора места биопсии и протоколов обработки образцов.
- Может потребоваться адаптация метода для других типов слизистых оболочек или контекстов аутоиммунных заболеваний тканей.
- Отрицательные результаты биопсии не исключают наличие заболевания, что требует тщательной интерпретации и возможного повторного тестирования.
