Выделение и проточная цитометрическая оценка нейроиммунных взаимодействий на мышиной модели с мини-инсультом

Область наших исследований сосредоточена на функции иммунных клеток после ишемического инсульта. Мы стремимся понять законы резидентных и инфильтрирующих иммунных клеток при патологии инсульта. В настоящее время проточная цитометрия широко используется для оценки функции иммунных клеток и взаимодействия при нейровоспалениях.

Кроме того, иммунометоды, а также секвенирование одиночных клеток и секвенирование продвигают исследования в области нейроиммунных взаимодействий. Наша лаборатория сосредоточится на иллюстрации пути астроцитов в нейроиммунных взаимодействиях, ангиовкладе в нейровоспалительные процессы. Для начала возьмите шприц объемом 50 миллилитров и прикрепите к его концу иглу 26 калибра.

Полностью заполните шприц физиологическим раствором. Расположите мышь под наркозом в положении лежа на поролоне. Вытяните передние и задние конечности и закрепите их с помощью игл 26 калибра.

С помощью зубчатых щипцов большого пальца захватите кожу живота и сделайте боковой разрез, чтобы обнажить печень. Разрежьте по обеим сторонам ребра, чтобы обнажить сердце. Теперь вставьте иглу 26 калибра в левый желудочек и разрежьте правый оракул.

Нажмите на поршень шприца, чтобы кровь вытекла. Продолжайте перфузию до тех пор, пока кровь, вытекающая из оракула, не станет прозрачной. После обезглавливания мыши и извлечения мозга перенесите его в стальную матрицу мозга мыши и разделите его на последовательные срезы роговицы толщиной два миллиметра.

Введите 500 микролитров ферментной смеси для пищеварения в каждую лунку 12-луночной пластины. С помощью микрощипцов деликатно отделите ткани инфаркта и перенесите ее в смесь ферментов пищеварения. Наконец, разрежьте ткань офтальмологических ножниц на мельчайшие кусочки и инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут.

С помощью пипетки AP 1000 осторожно отасуньте и дозируйте раствор 10 раз, чтобы диссоциировать ткань на отдельные клетки. Затем пропустите раствор через сетчатое фильтр с ячейками 70 микрометров. Многократно промойте планшет на 12 лунок и сетчатое фильтр ледяным HBSS, содержащим кальций и магний.

Теперь центрифугируйте собранную клеточную суспензию при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре PBS.

Затем, повторив процесс центрифугирования, снова суспендируйте гранулу в 150 микролитрах PBS и перенесите суспензию в 96-луночную круглую донную пластину. Снова центрифугируйте при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования крепко возьмитесь за 96-луночный планшет и быстро переверните его, чтобы удалить надосадочную жидкость.

Далее разбавляют жизнеспособность клеток флуоресцентным краем в соотношении один к ста в PBS и ресуспендируют гранулу в 150 микролитрах разбавленного раствора красителя. Выдерживать в течение 10 минут при комнатной температуре, защищая пластину от света. После центрифугирования в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия выбросьте надосадочную жидкость.

Разбавьте коктейль антител клеточной поверхности в магнитно-активированной сортировке клеток или максимальном буфере и, не промывая клетки, добавьте коктейль антител в лунки. Инкубируйте в течение 15–20 минут при температуре четыре градуса Цельсия, а затем центрифугируйте еще пять минут. После центрифугирования планшета и удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 150 микролитрах максимального буфера.

Переложите суспензию в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилира или пятимиллилитровые пробирки из полистирола с круглым дном. Спроектируйте многоцветную панель проточной цитометрии в соответствии с конфигурацией прибора с помощью ручных методов или онлайн-инструмента для проектирования панели. Включите в панель краситель для жизнеспособности клеток, чтобы исключить нежизнеспособные клетки и мусор из данных.

Отрегулируйте параметры детектора прямого и бокового рассеяния, чтобы убедиться, что интересующие ячейки отображаются правильно и могут быть правильно стробированы. Точная настройка параметров FSC и SSC для устранения мусора и посторонних шумов. На точечной диаграмме, показывающей зависимость площади FSC от высоты, отличайте дублеты от одиночных ячеек.

Используйте отрицательный сигнал красителя для определения жизнеспособности для выделения жизнеспособных клеток. Сравните контроль автофлуоресценции из неокрашенных клеток с положительным контролем окрашенных клеток, чтобы убедиться, что окрашенные клетки правильно масштабируются по каждому параметру. Выполните точную настройку компенсации, проанализировав многоцветные образцы ячеек и изучив два цветных точечных графика.

Отрегулируйте параметры компенсации в сторону увеличения или уменьшения до тех пор, пока популяции клеток не выровняются по вертикали или горизонтали друг с другом. Используйте сигналы CD45 и CD11B для различения лимфоцитов, микроглии, миелоидных клеток и астроцитов на основе их специфических паттернов экспрессии. Используйте фиктивную ткань мозга в качестве аутофлуоресцентного контроля, чтобы служить эталоном для идентификации лимфоцитов.

При анализе конкретной мишени используйте FMO-контроль с постинсультной тканью мозга. Соберите контрольные данные и сохраните их. Аналогичным образом соберите образцы данных и сохраните их.

Выберите и отсортируйте целевые клеточные популяции либо в пятимиллилитровые полистирольные пробирки с круглым дном, либо в 15-миллилитровые конические центрифужные пробирки. Добавьте 500 микролитров PBS и промойте пробирку для сбора, чтобы сохранить жизнеспособность клеток и способствовать образованию гранул. CCR7-положительная и CD11c-положительная микроглия была количественно определена на второй и седьмой сутки после ишемического инсульта.

Экспрессия CCR7 в микроглии резко возросла на второй день и оставалась повышенной на седьмой день по сравнению с фиктивным контролем. CD11c положительная микроглия следовала аналогичной тенденции, достигнув пика на второй день и оставаясь выше фиктивной на седьмой день. Точечные графики показали плотные сигналы CCR7 и CD11c на второй и седьмой дни.

Контрастирует с разреженными сигналами в фиктивном управлении. Стратегия гейтирования разделяла миелоидные клетки микроглии и лимфоциты с использованием экспрессии CD11B и CD45. Дополнительные маркеры определяли жизнеспособные клетки, астроциты и субпопуляции лимфоцитов.