Изучение последовательных клеточных событий фагоцитоза, вызванного Godanti Bhasma в клетках млекопитающих

Фагоцитоз, при котором фагоциты проглатывают и расщепляют чужеродные частицы. Это имеет решающее значение для иммунной защиты. Для эффективного мониторинга и оценки этого сложного клеточного процесса необходимы усовершенствованные и удобные для пользователя методы.

Фиксация событий деградации в режиме реального времени и предотвращение артефактов от фотообесцвечивания остаются ключевыми проблемами в точном изучении фагоцитоза и внутриклеточного трафика. В отличие от флуоресцентных или синтетических частиц, в нашем протоколе используется Godanti Bhasma, безметочная частица, позволяющая напрямую визуализировать стадии фагоцитоза без фотообесцвечивания, оптимизации или сложной подготовки. Эти результаты обеспечивают воспроизводимую модель для анализа фагоцитарных механизмов, предлагая новые инструменты для изучения везикулярной динамики, дисфункции патогена и потенциального терапевтического вмешательства при иммунных и лизосомальных нарушениях.

Мы стремимся исследовать молекулярные регуляторы фагосом созревания, исследовать фагоцитарную дисфункцию в моделях заболеваний и проводить скрининг потенциальных препаратов, которые модулируют везикулярную динамику и внутриклеточный транспорт. Для начала взвесьте ровно 100 миллиграммов порошка Godanti Bhasma или GB. Суспендируйте порошок в 10 миллилитрах ДМЭМ, дополненного 10%-ным FBS и 1%-ным пенициллином стрептомицина.

Тщательно перемешайте содержимое суспензии и дайте смеси постоять одну минуту, чтобы более крупные частицы осядли на дне. С помощью пипетки переложите верхние пять миллилитров суспензии в стерильную центрифужную пробирку. Пометьте пять миллилитров перенесенной суспензии GB в качестве исходного раствора для дальнейшей работы с клеточными культурами.

Еще раз тщательно перебейте суспензию в вихрь, чтобы обеспечить равномерное рассеивание частиц перед добавлением ее в ячейки. Засейте 3, 10 в четвертой степени 3T3-L1 клетки в 35-миллиметровую посуду, содержащую два миллилитра DMEM. Инкубируйте чашку при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с содержанием углекислого газа 5%, пока клетки не достигнут 70% конфлюенции.

Затем 300 микролитров бульонной суспензии ГБ тщательно перемешать с двумя миллилитрами предварительно подогретой свежей питательной среды. Поместите чашку с культурой, содержащую клетки и суспензию GB, в инкубатор микроскопа для визуализации. Выберите объектив с 10-кратным увеличением на микроскопе.

Включите подсветку светлого поля с помощью кнопки Яркость. Затем запустите программное обеспечение DIGI ImagePlus и выберите подходящую камеру. Нажмите кнопку «Захват» и выберите опцию замедленной съемки.

Установите время интервала в пять минут и начните запись, нажав кнопку «Готово». Непрерывная съемка изображений в ярком поле с пятиминутным интервалом в течение 16–24 часов в инкубаторе углекислого газа микроскопа. Используйте программное обеспечение ImageJ для компиляции всех отснятых изображений в покадровое видео.

Это позволяет идентифицировать стадии фагоцитоза от интернализации частиц до их полной деградации. После 24 часов роста клеток в 96-луночных планшетах тщательно перемешайте суспензию частиц GB. В каждую лунку добавьте по 30 микролитров суспензии.

Используйте лунки без частиц GB в качестве отрицательного контроля. Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в течение 24 часов, чтобы вызвать образование вакуоли. Для приготовления нейтрального красного раствора растворите нейтральный красный из расчета 0,5 миллиграмм на миллилитр раствора в сыворотке ДМЭМ, не содержащем ДМЭМ.

Отфильтруйте раствор через фильтр 0,2 микрометра. Для визуализации извлеките среду из 96 луночных планшетов. Добавив по 60 микролитров фильтрующего красителя в каждую лунку, инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Трижды промойте лунки PBS, чтобы удалить излишки красителя. Затем приступайте к микроскопической визуализации. Исследуйте окрашенные вакуоли под микроскопом с помощью объектива 20x, чтобы оценить размер, морфологию и количество вакуолей.

Для приготовления бафиломицина А1 стокового раствора растворите 100 микрограмм соединения в 50 микролитрах диметилсульфоксида. Затем разбавьте его 950 микролитрами DMEM. Для рабочего раствора разведите один микролитр запаса в 1,6 миллилитрах DMEM до получения конечной концентрации 0,1 наномоляра.

Рабочий раствор тщательно перемешать и добавить по 100 микролитров в лунки, содержащие клетки в 96 луночных планшетах. Затем инкубируйте клетки в каждой лунке с 30 микролитрами суспензии частиц GB, чтобы изучить ингибирование образования вакуоли и фагосомы. Для подавления закисления фагосом добавляют 100 мкл рабочего раствора бафиломицина А1 в лунки с предварительно сформированными вакуолями, предварительно обработанными ГБ. Инкубируйте все лунки при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в течение 24 часов.

Добавьте в каждую лунку по 60 микролитров нейтрального красного красителя. Инкубируйте в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия и трижды промойте лунки PBS для удаления излишков красителя, затем проанализируйте вакуолообразование и закисление под микроскопом. Обработайте культивируемые клетки 50 микролитрами суспензии GB и инкубируйте их в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в стандартных экспериментальных условиях.

После обработки добавьте в клетки раствор акридина апельсина в концентрации один миллиграмм на миллилитр и инкубируйте в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы окрашивать вакуоли и кислые везикулярные органеллы. Затем трижды промойте клетки стерильным PBS, чтобы удалить любой несвязанный краситель и уменьшить фоновую флуоресценцию. Наконец, немедленно проанализируйте окрашенные слайды с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного 20-кратным объективом и синим фильтром возбуждения в диапазоне от 450 до 492 нанометров.

Оцените клеточную морфологию и поглощение акридинового апельсина, чтобы понять вакуолярную динамику. После 30 минут обработки GB, наблюдались частицы, прикрепленные к поверхности трех клеток 3T3-L1. Вокруг частицы появилось чашеобразное расширение мембраны, указывающее на начало поглощения частицами.

Через 12 часов после обработки внутри клеток наблюдались большие мембранно-связанные вакуоли, содержащие частицы GB. Покадровая визуализация продемонстрировала ступенчатую интернализацию и образование вакуоли в одной живой клетке в течение 4,75 часов. Частицы GB в вакуолях постепенно деградировали с течением времени, и клетка восстановила нормальную морфологию, о чем свидетельствует вакуолярный оборот.

Анализ проточной цитометрии показал, что интернализованные частицы Godanti Bhasma полностью разлагаются в течение 24 часов, при этом в культуральной среде не остается частиц. Нейтральное красное окрашивание показало значительно более высокое закисление вакуоли в обработанных GB-клетках всех трех клеточных линий по сравнению с контрольной группой, которая показала только слабое лизосомальное окрашивание. Окрашивание акридином в оранжевый цвет показало оранжево-красную флуоресценцию в вакуолях клеток GB 3T3-L1, указывающую на закисление, в то время как необработанные клетки показали только зеленую флуоресценцию.

Совместное лечение бафиломицином ингибировало образование вакуолей как в клетках 3T3-L1, так и в клетках HeLa, о чем свидетельствует отсутствие вакуолей по сравнению с их соответствующим контролем. После обработки бафиломицином нейтральный красный захват был эффективно заблокирован, что нарушило закисление вакуоли и созревание в клетках.