Конвейер смесей для генерации молекулярных оперативных таксономических единиц (MOTU) среди прибрежных и водных жуков

Стремясь ускорить обнаружение видов в МЕГА разнообразных тропиках, этот протокол направлен на создание гипотезы кластеризации видов у водных и прибрежных жуков с использованием набора компьютерного анализа.

Этот конвейер смесей, в котором использовалась последовательность ДНК COI, привел к большему количеству доказательств разграничения видов для плотного жука из рода Anisostena, который ранее был построен только с использованием морфологических данных.

Этот протокол направлен на устранение таксономического препятствия, заключающегося в том, что открытие видов с помощью таксономии, основанной на морфологии, которая считается золотым стандартом в систематике насекомых, часто отнимает много времени и сбивает с толку малоизученных, но МЕГА разнообразных и очень неприметных водных жуков.

[Эммануэль] Этот конвейер генерирует молекулярные акцессорные гипотезы, называемые MOTU, независимо от того, соответствует ли последовательность известным видам в соответствии с указанными последовательностями, или же они не открыты или не описаны.

Таким образом, вместо того, чтобы препарировать и сравнивать сотни гениталийных структур жуков одновременно, конвейер обеспечивает предварительную кластеризацию, по которой образцы могут быть тщательно изучены на предмет конспецифичности.

[Рассказчик] Для начала запустите MEGA X и загрузите последовательности ДНК для выравнивания. Откройте интерфейс трассы, выбрав линию, затем нажмите «Редактировать» или «Построить трассу» и выберите «Создать новую трассу». Нажмите OK, чтобы подтвердить выбор, и выберите DNA в качестве типа данных. Наведите указатель мыши на вкладку редактирования. Нажмите на кнопку "Вставить последовательность" из файла. Перейдите в соответствующий каталог и выберите файлы последовательности для загрузки в MEGA. Теперь нажмите на выравнивание, затем выберите align by ClustalW, чтобы выровнять последовательности с использованием настроек по умолчанию, и нажмите OK, чтобы продолжить. Для ручного редактирования последовательностей удалите все вставки, щелкнув по вставленным основаниям или позициям и нажав клавишу Delete на клавиатуре. Затем исправьте удаления, нажав на черешок, представляющий отсутствующую базу, удалив ее и введя предполагаемую базу. Затем найдите самую раннюю позицию, где все последовательности содержат символ. Нажмите на пустое поле в заголовке строки сразу слева от этой позиции и перетащите, чтобы выбрать все лишние начальные позиции. Нажмите Delete, чтобы обрезать их. Затем найдите последнее выровненное положение и нажмите на поле справа от этой точки. Нажмите Delete еще раз, чтобы обрезать конец. Теперь выберите все последовательности и перейдите на вкладку «Транслируемые белковые последовательности». При появлении запроса проверьте генетический код как митохондриальный беспозвоночный. Если генетический код отличается, нажмите «нет», и появится меню, позволяющее поставить галочку в поле для митохондриального генетического кода беспозвоночных. Если стоп-кодоны, отмеченные звездочкой в выравнивании, появляются по всему столбцу, нажмите на последовательности ДНК и удалите первую позицию для всех последовательностей. Снова нажмите на последовательности ДНК, затем сохраните выравнивание в формате .mos или .mosx. Чтобы начать разграничение с помощью модуля TaxonDNA, откройте программное обеспечение TaxonDNA. Нажмите на импорт, затем выберите FASTA и загрузите файл выравнивания в формате FASTA. Теперь нажмите на модули, затем выберите кластер. Установите пороговое значение на 3% и установите флажок с надписью «Генерировать индивидуальную информацию по каждому кластеру». Нажмите на кнопку «Создать кластеры» сейчас, чтобы начать кластеризацию и сохранить результаты, сделав скриншот. Для разграничения с помощью метода Kimura 2-Parameter откройте MEGA и нажмите на файл, затем выберите открыть файл или сессию. Нажмите на расстояние. Выберите Вычислить попарные расстояния и подтвердите файл .meg для разграничения. Наведите курсор на поле рядом с моделью или методом и нажмите стрелку, чтобы развернуть раскрывающееся меню. Выберите модель Kimura 2-Parameter и нажмите OK, чтобы запустить программу. Откройте окно вывода данных для просмотра результатов. Нажмите на файл, затем выберите экспорт и печать расстояний, чтобы сохранить результат. Откройте собранный вид с помощью автоматического разбиения на разделы или как можно скорее на веб-сервере. Нажмите на оранжевое поле с надписью «Выберите файл» и загрузите файл .fasta. Прокрутите вниз и нажмите «Перейти». Чтобы скачать результат кластеризации, нажмите на список строки с самым низким баллом ASAP и самым высоким рангом P-значения. Далее, чтобы начать оценку дерева, откройте MEGA и нажмите на данные. Затем выберите «Открыть файл или сеанс», чтобы загрузить файл .meg. Нажмите на модели, затем выберите «Найти лучшие модели ДНК и белков» или ML, чтобы определить наиболее подходящую модель замещения. Нажмите кнопку «ОК» в меню настроек анализа. Теперь, чтобы создать дерево, нажмите на филогенез, затем выберите «Построить и протестировать дерево максимального правдоподобия». Используйте наиболее подходящую модель замещения, нажав на поле рядом с моделью или методом и выбрав подходящую модель из выпадающего меню. В разделе Тест на филогенез нажмите на поле рядом с тестом филогенеза, затем выберите метод bootstrap из выпадающего меню. Нажмите на поле рядом с числом бутстреп-репликаций. Введите 1 000 и нажмите OK, чтобы запустить анализ. Как только откроется окно, содержащее результирующее дерево, сохраните сеанс в виде файла .mts или .mtsx. Также сохраните выходные данные в виде файла .newick и экспортируйте дерево как изображение .png. Сведения о разграничении на основе PTP см. на веб-сервере PTP. Нажмите на кнопку «Выбрать файл» и загрузите дерево в формате Newick. Под моим деревом выбрано укорененное. В поле под названиями таксонов внешней группы введите внешнюю группу, введя имя наконечника таксона. Затем, в разделе «Решение с максимальным правдоподобием», нажмите «Скачать результаты разграничения», чтобы сохранить выходные данные PTP ML. Аналогичным образом, в решении с наибольшей байесовской поддержкой нажмите «Скачать результаты разграничения», чтобы сохранить выходные данные PTP BI. Чтобы узнать об ограничении MPTP на основе MPTP, посетите веб-сервер MPTP. Загрузите файл Newick, перетащив его на серый квадрат или кликнув по квадрату. Как только данные будут загружены, нажмите «Перейти к выбору группы». На странице спецификации внешней группы выберите внешнюю группу, установив флажок рядом с метками таксонов экземпляров внешней группы. Затем нажмите на выбор модели, выберите MPTP и нажмите на параметры визуализации. На странице параметров визуализации примите настройки по умолчанию. Нажмите «Отправить». Щелкните правой кнопкой мыши файлы в разделе «Загружаемые файлы» и выберите «Сохранить как», чтобы сохранить результаты. Теперь, чтобы сгенерировать молекулярные операционные таксономические единицы или MOTU, откройте дерево с помощью программы для редактирования фотографий или PowerPoint. Создайте столбец, представляющий результаты каждого подхода к разграничению молекулярных видов. Если все подходы дают идентичные результаты для данного молекулярного кластера, обозначьте кластер как MOTU на основе консенсуса. На этом рисунке представлены результаты генного дерева с максимальным правдоподобием и молекулярной кластеризации для жуков-боранусов на основе 3-простых последовательностей COI и шести методов разграничения. Все методы последовательно идентифицировали четыре MOTUS: Byrrhinus negrosensis, Byrrhinus villarini Byrrhinus A и Byrrhinus B с идентичной кластеризацией по методам. Byrrhinus negrosensis и Byrrhinus villarini были четко разделены, несмотря на то, что происходят из одних и тех же мест. Последовательности из четырех провинций были сгруппированы в Byrrhinus A, не демонстрируя сильной географической структуры. На этом рисунке показана кластеризация жуков Anisostena в четыре MOTU, включая Anisostena angatbuhay, Anisostena auxilium, Anisostena A и Anisostena B с полным согласованием методов. Anisostena auxilium географически перекрывалась с Anisostena A и Anisostena B, что указывает на то, что география сама по себе не объясняет молекулярную дивергенцию.