В естественных условиях Визуализация нейронной активности у взрослых мух дрозофилы без анестезии

Мы пытаемся понять молекулярную, клеточную и цепную основу естественного забывания памяти, стремясь раскрыть, как мозг активно стирает или подавляет воспоминания для поддержания когнитивной гибкости. Недавние исследования показали, что забывание — это не просто пассивный распад воспоминаний, а скорее строго регулируемый активный биологический процесс, требующий определенных паттернов нейронной активности.

Основная проблема заключается в том, чтобы связать конкретные манипуляции с цепями с процессами динамической памяти при одновременной интеграции коннектомических, генетических и поведенческих данных в строгом и интерпретируемом виде. Мы помогли установить, что забывание является активным биологически регулируемым процессом. Наша работа идентифицировала специфические дофаминергические нейроны и молекулярные пути, необходимые для нормального забывания в мозге дрозофилы. Наш протокол позволяет проводить функциональную визуализацию у мух без анестезии, предотвращая нежелательные неспецифические эффекты под действием анестетиков. Мы используем этот подход для исследования нейронных коррелятов, лежащих в основе формирования памяти и активного забывания памяти.

[Рассказчик] Для начала с помощью инструментов Dremel и алмазного пильного диска отрежьте металлическую трубку для подкожных инъекций 22-го калибра длиной примерно 10 сантиметров. С помощью отрезного круга Dremel 420 отполируйте оба конца трубки, чтобы создать гладкое и чистое отверстие, в котором можно разместить хоботок мухи. Оберните отрезанную трубку вокруг 15-миллилитровой центрифужной трубки, чтобы сформировать желаемую изогнутую форму. Затем отрежьте 7-сантиметровый кусок металлической трубки для подкожных инъекций 12-го калибра. Теперь с помощью бритвенного лезвия обрежьте конец наконечника пипетки объемом 2 микролитра, чтобы он соответствовал металлической трубке 22-го калибра. Вставьте трубку 12-го калибра в другой конец наконечника для дозатора. Далее смешайте небольшое количество эпоксидной смолы и отвердителя вместе. Нанесите эпоксидную смолу на стыки, где маленькая металлическая трубка встречается с наконечником пипетки и где большая трубка соединяется с другим концом. Дайте эпоксидной смоле полностью застыть в течение ночи, прежде чем подключать узел к держателю микроманипулятора и регулировать угол по мере необходимости. Чтобы создать пипетку для подачи удара и запаха, отрежьте 1 миллилитр от стеклянной пипетки размером 1 x 100 на отметке 3 миллилитра с помощью алмазного инструмента Dremel. Затем вырежьте небольшой прямоугольный акриловый лист размером 24,5 миллиметра х 8 миллиметров толщиной 1/8 дюйма. Вырежьте медную ударную сетку, чтобы она поместилась на прямоугольную акриловую деталь. Припаяйте два электрических провода к противоположным концам медной сетки. Теперь поместите медную сетку на акриловый кусок и слегка согните ее, чтобы вместить брюшко и ноги мухи. С помощью изоленты прикрепите медную сетку к акриловой детали. Затем с помощью пистолета для горячего клея прикрепите стеклянную пипетку к ударной решетке, убедившись, что она прямая и центрирована. Чтобы построить записывающую камеру, в качестве основания камеры возьмем предметное стекло микроскопа. Смешайте смолу и эпоксидный клей вместе. С помощью эпоксидного клея прикрепите неодимовые магниты ко всем четырем углам черной акриловой камеры. Поместите дополнительный магнит поверх каждого приклеенного магнита. Затем приклейте вновь размещенные магниты к предметному стеклу с помощью эпоксидной смолы. Удерживайте сборку на месте с помощью скрепок во время отверждения. Извлеките наконечник пипетки объемом 200 микролитров из аспиратора. Вставьте аспиратор во флакон, содержащий дрозофилу, и втяните одну муху в наконечник пипетки объемом 1000 микролитров. Установите наконечник пипетки объемом 200 микролитров обратно на аспиратор. Затем осторожно подуйте и щелкните аспиратором так, чтобы муха была обездвижена головой вперед в верхней части наконечника пипетки объемом 200 микролитров. Далее поместите камеру для вскрытия на держатель манипулятора. Подсоедините вакуум к трубке для удержания мух и отрегулируйте скорость потока примерно до 500 миллилитров в минуту. Теперь переместите вакуумную металлическую трубку в центр поля зрения микроскопа. Аккуратно отсасывайте хоботок мух в вакуумный держатель. Отрегулируйте манипулятор так, чтобы выровнять головку мухи с отверстием камеры. Включите источник питания постоянного тока. С помощью платиновой проволоки сопротивления нанесите расплавленную миристиновую кислоту на приклеивание глаз и грудной клетки к камере. Закрепив их, отсоедините вакуумную трубку. Снимите записывающую камеру с вакуумного соединения с помощью манипулятора и переверните камеру вверх дном. Затем приклейте хоботок снизу, используя стойкость платины. Когда все будет склеено, выключите электроснабжение постоянным током. Затем переверните камеру в вертикальное положение. Прикрепите камеру к основанию стеклянного предметного стекла. Отрежьте ножницами небольшой кусочек скотча и поместите его спереди и позади головы мухи. Поверните камеру так, чтобы голова мухи была обращена к экспериментатору под углом 90 градусов. Рассекающей иглой сделайте вертикальные надрезы по бокам глаз. Поверните камеру в горизонтальном направлении. Затем сделайте горизонтальный надрез поперек кутикулы. Теперь добавьте 100 микролитров физраствора на макушку головы мухи. С помощью острых щипцов удалите окно кутикулы, затем удалите остатки жира или трахеи с помощью щипцов. Поместите подготовленную муху на предметный столик конфокального микроскопа, оснащенного лазером и объективом для погружения в воду. С помощью микроманипулятора отрегулируйте положение решетки шока и пипетки для запаха, чтобы муха была правильно расположена на решетке амортизатора. С помощью ручки регулировки курса по оси z выполните сканирование по оси z мозга и найдите интересующую область мозга. Установите размер кадра на 512 x 512 пикселей. Начните запись с интересующего вас нейрона с помощью специально изготовленной или коммерчески доступной системы доставки запаха. Установите продолжительность записи равной 2 минутам. Запустите протокол обучения с помощью системы доставки запаха через 5 минут после сбора ответов перед дрессировкой. Затем запишите ответы после тренировки примерно через 5-15 минут после тренировки. Индикатор кальция GCaMP6f и красный флуоресцентный белок tdTomato селективно экспрессировались в выходном нейроне тела гриба с дендритами, проецирующимися в гамма- и альфа-доли тела гриба, и нейрон визуализировали с помощью линии драйвера MB077C split-GAL4. Реакция кальция в выходном нейроне тела гриба на 3-октанол была значительно снижена через 5 минут после обратного кондиционирования без анестезии и оставалась подавленной в течение 15 минут. Напротив, реакция кальция на 4-метилциклогексанол была значительно усилена через 5 минут после тренировки и оставалась повышенной через 15 минут. Псевдоцветные изображения продемонстрировали отчетливые изменения флуоресценции до и после тренировки. У мух под наркозом реакция кальция на CS+ после тренировки была снижена лишь частично, и реакция на CS- существенно не отличалась от исходного уровня. Количественный анализ подтвердил, что реакция CS+ была значительно подавлена после обучения у мух, находящихся под наркозом, но реакция CS-оставалась статистически неизменной. Пластичность была значительно выше у мух без анестезии по сравнению с мухами под наркозом.