Многоразовый инструмент для печёночной визуализации: многоразовый 3D-печатный инструмент для печёночной интравитальной микроскопии

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать многоразовый инструмент гепатичной визуализации (RHIT) как прорывной инструмент для сбора высококачественных, динамичных биологических данных, особенно в области исследований печени. Традиционные научные методы изучения мышей в контролируемых экспериментах давно опирались на наблюдение за поведением, физиологический мониторинг и генетический анализ. Сложность этих исследований часто приводит к несогласованным или ограниченным результатам данных.

Многие эксперименты опираются на данные, которые либо неполны, либо трудно интерпретируемы, например, короткие вспышки низкокачественных изображений, которые быстро исчезают, затрудняя фиксировать долгосрочные тенденции или тонкие изменения. Вводим RHIT, обеспечивающий динамичное, высокоразрешающее захват для исследований печени и за их пределами. Демонстрируемая нами техника позволяет изготавливать индивидуальные инструменты для визуализации с использованием доступных материалов и широко доступных технологий 3D-печати.

Разработанный для использования в академических и ограниченных ресурсах средах, этот подход позволяет быстро разрабатывать и внедрять устройства для поддержки высококачественной in vivo визуализации. Наш многоразовый инструмент для гепатичной визуализации (RHIT) был разработан для улучшения стабильности тканей во время интравитальной микроскопии печени. Модульная конструкция RHIT позволяет мышам разных размеров и поддерживать расширенную визуализацию динамических метаболических процессов с минимальными физиологическими нарушениями.

RHIT изготавливается в один этап с использованием акрилонитрила, бутадиена, стирола, ABS — термопластика, выбранного за лёгкий вес, термостабильность и механическую прочность. Регулировав плотность материала, RHIT эффективно поглощает движение, вызванное дыханием и сердцебиением, тем самым уменьшая артефакты изображения и повышая чёткость. Химическая инертность и водорастворимость ABS обеспечивают доступность биологической ткани и обеспечивают эффективную очистку и повторное использование.

Чтобы воссоздать RHIT, используйте 3D-программное обеспечение для проектирования продуктов. Для этой конструкции использовался Autodesk Inventor. Откройте Autodesk Inventor и создайте новую стандартную деталь.

Сохраните файл с соответствующим описанием. Создайте эскиз RHIT на передней плоскости с помощью функции создания 2D-эскизов. Нажмите на иконку прямоугольника и разместите его нижний левый угол в начале плоскости эскиза.

Нарисуйте второй прямоугольник внутри первого, чтобы представить окно визуализации RHIT. Добавьте размерности к обоим прямоугольникам с помощью особенности размерности, обеспечивая, чтобы все длины и ширины были сопоставлены с началом координат и относительно друг друга. Регулируйте размеры RHIT в зависимости от размера мыши.

Добавьте толщину RHIT, выбрав только внешний прямоугольник и экструдируя эскиз с помощью инструмента экструды, чтобы оставить отверстие в центре. Выберите нижнюю грань экструдированного RHIT и начните новый 2D-эскиз с помощью функции стартового 2D-эскиза. Нарисуйте прямоугольник, чтобы определить карман для грелки.

Определите размеры прямоугольника исходя из размера и толщины грелки, которая будет вставлена в этот слот. Эти измерения должны соответствовать физической грелке, используемой для точного моделирования температуры млекопитающего. Примените необходимые размерности с помощью признака размерности.

Выйдите из 2D-эскиза и выполните удаление материала с помощью инструмента вырезанного экструдирования, чтобы создать глубокую полость для нагревательной площадки. Увеличивайте по мере необходимости, чтобы точно расположить эскиз. Начните новый эскиз температурного датчика на той же поверхности, что и полость.

Нажмите «Начать 2D-эскиз» и выберите иконку круга. Разместите круг на ровной поверхности и соответствуйте размеру. Выйдите из режима эскиза.

Нажмите на extrude и выберите эскиз круга. В режиме экструзии нажмите на «Резать, экструдировать и удалить материал». Разместите круг с правой стороны лица вместе с карманной вставкой.

Пока не нужно быть центрированным. Добавьте размеры, чтобы выровнять его с центром толщины RHIT. Нажми «экструзи».

Появится всплывающее окно со стрелкой, показывающей направление разреза, а также опция «сквозь все». Выберите через все, чтобы разрезать весь материал, затем нажмите OK. Выйти из режима экструзии.

Добавьте филе по краям окна, кликнув на иконку филе и выберите все восемь острых краёв. Добавьте размер филе и режим выхода из филе. Подготовьте модель к 3D-печати, перейдя на вкладку окружения и выбрав вкладку 3D-печати.

Чтобы распечатать немодифицированный RHIT, импортируйте STL-файл либо с рисунка 1A, либо с дополнительных материалов, в программное обеспечение для подготовки 3D-печати A. Нажмите «Импорт», выберите файл и «Подготовить», чтобы разрезать модель на печатные слои. Выберите совместимый коммерческий 3D-принтер и нажмите печать.

Следите за процессом печати. Когда всё будет готово, аккуратно удаляйте и очищайте напечатанный RHIT по мере необходимости. Подождите 10–15 минут после удаления, прежде чем начинать операцию и визуализацию.

Подготовка микроскопа и использование RHIT. Подготовьте обычный инвертированный конфокальный микроскоп для печени IBN, как показано на рисунке 2A. Вставьте адаптер для сэмпла.

Для этого протокола использовалась специально изготовленная металлическая вставка с круглым отверстием диаметром 35 мм и стеклом для крышки диаметром 40 миллиметров. Тщательно очистите обе стороны стекла до и после визуализации, используя 70% этанола по мере необходимости. Закрепите соответствующий RHIT в зависимости от размера мыши лентой, выровняя диафрагму RHIT с объективом, параллельно скользящему покрытию изображения, как показано на рисунке 2G, на металлической вставке с лентой на стекло крышки.

Выбирайте объектив для съёмки на основе размера площади, пространственного разрешения и времени съёмки, например, объектив 25X на 95 вод. Выровняйте объектив близко к стеклу крышки. Закрепите полоску марли на мокром окне скотчем.

Это поможет расположить ткань и отделить её от других органов брюшной полости. Предварительный RHIT с помощью грелки вставленной в слот и закрепления теплового датчика рядом с RHIT, показано на рисунках 2G по H. Это поддерживает температуру тела мыши во время съёмки. Сбрийте брюшную шерсть с помощью машинки для стрижки и/или крема для удаления волос.

Уберите остатки волос и продезинфицируйте открытую кожу 70% этанолом. В зависимости от требований учреждения IACUC, может использоваться чередующее очищение бетадина и этанола для обеспечения надлежащей подготовки хирургического участка. Переоцените глубину анестезии перед операцией на животном.

Обнажите печень, сделав горизонтальный полумесяцовидный разрез диаметром 2–3 сантиметра под грудной клеткой хирургическими ножницами из ксифовидной кости, заканчивающийся на левой боковой стороне верхней части живота. После первоначального разреза аккуратно сделайте меньший вторичный разрез в мышечном слое, чтобы открыть левую долю печени. Прижигайте по необходимости, чтобы избежать кровотечения.

Предотвращайте тепловое повреждение печени при использовании каутеризатора, поместив марлю, пропитанную физиологическим раствором, между печенью и мышечным слоем для поглощения исходящего тепла мышцы. Избегайте чрезмерных кровотечений, хирургических или механических травм, а также внешней компрессии. После обнажения печени переведите мышь на стадию микроскопа.

Расположение мыши на стадии микроскопа. Разместите живот обезболезненной мыши лицом вниз на платформу RHIT микроскопа. Отрегулируйте носовой конус так, чтобы мышь оставалась под анестезией.

Используйте аппликатор, пропитанный в физиологическом растворе, с хлопковым наконечником, чтобы аккуратно направить левую боковую долю печени к закрытке, одновременно оказывая внешнее давление на грудную полость. Используйте гравитацию, чтобы аккуратно вывести печень на стекло крышки. Используйте марлевую полоску, чтобы аккуратно отделить печень от тела мыши.

Проверьте носовой конус ещё раз, чтобы убедиться, что мышь находится под анестезией во время обследования. Предотвращайте обезвоживание тканей, нанося гель на водную основу по краям открытой полости и избегая прямого контакта с грелкой. Микроскоп с закрытой камерой для влажности также помогает поддерживать температуру и влажность.

Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить пересыхание роговицы. Наконец, настройте таймлапс IVM для начала визуализации. Откройте лазерные затворы, оцените флуоресцентную маркировку и определите стабильную область интереса с заметным кровотоком.

Выберите подходящие варианты получения изображений, включая формат, скорость, интервалы съёмки, продолжительность времени, средний уровень кадра и так далее. При необходимости определите верхнюю и нижнюю границы Z-стеков и начните таймлапс-запись. Для проверки протокола мы количественно оценили стабильность изображения с помощью индекса структурного сходства (SIM), показанного на рисунке 3D.

SIM сравнивает два изображения на основе яркости, контраста и структурных узоров. Значение единицы указывает на совершенное сходство, а ноль отражает искажение. Рисунок 3C показывает, что RHIT стабильно даёт самые высокие значения SIM-карты — до 50 раз больше, чем отсутствие вставка, что демонстрирует превосходное качество изображения.

На изображениях с маркировкой A по C мы сравнивали IVM печени без стабилизатора, с картонным вставкой и с RHIT. RHIT сохраняет чёткую разрешение липидных капель в мадженте, ядер зелёного цвета и сосудистую систему в циане. Чёрно-белые вставки подчёркивают стабильность изображения.

RHIT также обеспечил долгосрочную работу IBM у мышей с ожирением более восьми часов, как показано в первом фильме. В совокупности эти результаты подтвердили, что RHIT значительно улучшает качество изображения и воспроизводимость в разных условиях. В совокупности RHIT упрощает сложную конфигурацию, традиционно необходимую для печёночного IBM, улучшая как воспроизводимость, так и доступность.

Этот подход предусматривает более широкое движение к использованию 3D-печати для стандартизации продвинутых протоколов визуализации. Помимо визуализации печени, принципы проектирования RHIT могут быть расширены и на другие области, включая томографию органов, материаловедение и инженерию, где стабильность движений критически важна для точности изображения.