Использование метода переноса капель для надежной подготовки гигантских однослойных везикул

Мы нацелены на создание клеточных микророботов, которые перемещаются по тканям тела для локального введения терапии. Они основаны на гигантских однослойных везикулах и фосфолипидной мембране и содержат активные частицы. Этот протокол предлагает руководство для новичков, которые хотят перенять и адаптировать метод переноса капель в синтетической биологии и в других областях, например, в микроробототехнике.

По сравнению с другими методами подготовки GUV, этот протокол обеспечивает высокую эффективность инкапсуляции и простоту выполнения, что делает его доступным для любой исследовательской группы с базовым лабораторным оборудованием. Мы оценим навигацию микророботов на основе GUV в тканеподобных условиях и реализуем сенсорные стратегии для обеспечения автономного движения к больным клеткам. Для начала переместите перчаточный стакан внутрь или рядом с химическим колпаком.

Откройте перчаточную камеру и поместите на дно камеры кристаллизатор, наполненный частицами кремнезема. Накройте кристаллизатор белой опорной поверхностью, а затем накройте его бумажными полотенцами. Вставьте все необходимые материалы в бардачок и поместите стеклянный флакон с раствором хлороформа на держатель пробкового кольца или стакан объемом 150 миллилитров, расположенный как можно ближе к стороне оператора.

Теперь закройте бардачок, убедившись, что две половины надежно выровнены и не могут скользить. Используйте прилагаемые пластиковые винты для полной герметизации камеры. Закройте выпускной клапан и погрузите трубу номер пять в стакан объемом 500 миллилитров, который наполовину заполнен водой.

Затем подсоедините регулируемый клапаном конец трубы номер два к вакуумной линии. Затем подсоедините другой конец к азотной магистрали с помощью трубы номер три. Откройте клапан и включите вакуумную линию до тех пор, пока перчатки не надуются и не станут слишком жесткими, чтобы их можно было согнуть.

Затем закройте вакуумную линию и клапан. Далее откройте азотную линию, пока перчатки не сдуются и не выйдут из бардачка. Надев перчатки, с помощью шприца Гамильтона переведите указанный объем DOPC в растворе хлороформа в темный стеклянный флакон.

Закройте флакон крышкой с иглами. Теперь соедините трубу номер шесть с трубой номер восемь и трубу номер семь с трубой номер девять с помощью двусторонних соединений. Снимите перчатки с перчаточной камеры и откройте выпускной клапан.

Затем медленно откройте азотную магистраль и следите за потоком газа на наличие пузырьков в стакане. Постепенно увеличивайте поток азота до тех пор, пока не будет достигнута устойчивая, но заметная скорость барботирования. После трех минут протекания закройте азотную линию.

Как только последний пузырь выйдет из стакана, закройте выпускной клапан. Наденьте перчатки обратно и отсоедините восьмую и девятую трубы от двусторонних соединений. Далее откройте флакон и переместите крышку обратно в 50-миллилитровую пробирку.

Затем откройте бутылку с маслом и перелейте необходимое количество масла в темный флакон. Снова закройте флакон крышкой, снимите перчатки и откройте бардачок. Энергично окуните герметичный флакон с липидной суспензией в течение не менее 30 секунд.

Затем выдержите его при температуре 80 градусов Цельсия на водяной бане в течение 30 минут. После повторного вортексирования флакона инкубируйте его в течение ночи при комнатной температуре. С помощью ножниц отрежьте колпачок от пятимиллилитровой трубки.

Просверлите отверстие диаметром около восьми миллиметров в центре колпачка, чтобы установить наконечник для пипетки P1000. Если отверстие слишком широкое, чтобы вместить наконечник, выбросьте колпачок и начните с нового. Полоской наждачной бумаги размером два на пять сантиметров разровняйте по краям просверленного отверстия.

Установите крышку обратно на пятимиллилитровую пробирку и центрифугируйте при температуре 3 000 г в течение пяти минут, чтобы удалить остатки пластиковых частиц. Затем снимите крышку и выбросьте тюбик. Теперь отрежьте колпачок от нового пятимиллилитрового тюбика и замените его подготовленным продырявленным колпачком.

Вставьте наконечник P1000 в отверстие с уплотнительным кольцом, заблокированным между наконечником и колпачком, чтобы предотвратить дальнейшее движение вниз. Заполните трубку 5,5 миллилитрами наружного раствора через наконечник. Вортекс приготовленный ранее флакон с липидной суспензией не менее 30 секунд.

Затем инкубируйте его на водяной бане при температуре 50 градусов Цельсия в течение 30 минут. Дайте приготовленным ранее водным растворам сбалансироваться при комнатной температуре не менее 10 минут. Теперь пипеткой нанесите 300 микролитров наружного раствора в 1,5-миллилитровую пробирку или ранее модифицированную пятимиллилитровую пробирку.

Медленно нанесите 100 микролитров липидной суспензии поверх масляного раствора, обеспечивая образование двух отдельных и непрерывных фаз. Дайте интерфейсу постоять в течение 10 минут, чтобы он стабилизировался. В двухмиллилитровую пробирку пипеткой нанесите 250 микролитров липидной суспензии, а затем 6,25 микролитров внутреннего раствора для приготовления 2,5%-ной водно-масляной эмульсии.

Смешайте две фазы до тех пор, пока эмульсия не станет однородной и стабильной. Перенесите 200 микролитров приготовленной эмульсии на образовавшуюся ранее границу раздела липидной суспензии масляного раствора. Если вы используете трубку объемом 1,5 миллилитра, просто закройте трубку.

Если вы используете модифицированную пятимиллилитровую трубку, наденьте резиновый колпачок на наконечник пипетки и аккуратно перенесите всю пробирку в 50-миллилитровую коническую трубку. Центрифугируйте пробирки при комнатной температуре с соответствующей скоростью. После центрифугирования убедитесь, что внизу присутствует непрозрачная гранула, а вверху масляная фаза прозрачна.

Чтобы удалить масло из пятимиллилитровой трубки, содержащей GUV, извлеките наконечник пипетки из трубки, убедившись, что резиновый колпачок остается на месте. Выбросьте наконечник и сохраните резиновый колпачок, уплотнительное кольцо и колпачок для использования в будущем. Вместо этого, если вы используете пробирку объемом 1,5 миллилитра, используйте микропипетку P1000 для удаления масляного раствора, оставляя около 50 микролитров и следя за тем, чтобы не потревожить гранулу.

Поменяйте наконечник пипетки, затем повторно суспендируйте гранулу в оставшихся 50 микролитрах раствора. Наконец, переложите ресуспензионный материал в чистую двухмиллилитровую трубку. Липидные растворы, приготовленные в условиях высокой влажности, давали гигантские униламеллярные везикулы со значительно меньшим выходом и большей распространенностью неупорядоченных агрегатов по сравнению с приготовленными в камере с контролируемой влажностью, хотя некоторые агрегаты все еще присутствовали в последней.

При дозе 3 300 г в течение 20 минут выход и качество везикул, содержащих сахарозу, были оптимальными, в то время как более низкие и высокие скорости центрифугирования приводили к неблагоприятным результатам, таким как снижение выхода или образование заполнителей. Минеральное масло приводило к образованию везикул с большим средним распределением диаметра, в то время как силиконовое масло AR 20 генерировало значительно большее общее количество везикул.