Одновременный 3D-анализ повреждения сердца и иммунного ответа при реперфузном остром инфаркте миокарда с помощью световой листовой флуоресцентной микроскопии

Мы изучаем взаимодействие иммунных клеток и поврежденных тканей после инфаркта миокарда. Мы стремимся понять иммунный ответ и улучшить работу сердца. Было высказано предположение, что после инфаркта миокарда все три основных клеточных образования, кардиомиоциты и клетки и иммунные клетки, должны быть модулированы с помощью многоцелевых стратегий одновременно.

В дополнение к одновременному анализу повреждения сердца и ответа на него, мы смогли показать 3D-локализацию этих поврежденных участков, которая ранее была неизвестна. 3D-анализ, особенно при мультиплексировании различных мишеней, обеспечивает более надежный способ оценки клеточного состава после инфаркта миокарда. Для начала поместите усыпленную мышь под стереомикроскоп.

С помощью тонких ножниц вскройте грудную полость и разрежьте обнаженную верхнюю полую вену близко к выходу сосуда из грудной клетки в шею. С помощью иглы 27-го калибра, прикрепленной к роликовому насосу, перфузируйте сердце in situ через правый и левый предсердные оракулы с PBS, содержащим гепарин. Подтвердите достаточное удаление сердечной крови, наблюдая за затуханием поверхностного сосудистого рисунка сердца и отбеливанием легких и печени.

Иссеките сердце вместе с не менее чем пятью миллиметрами оставшейся аорты и окружающей легочной ткани с помощью щипцов и ножниц и перенесите его в шестисантиметровую чашку Петри, предварительно заполненную ледяной PBS и марлей. Теперь отрежьте оставшиеся легкие, жир и сосудистую ткань, пока не останется только сердце с примерно пятью миллиметрами аорты. Перенесите сердце в чашку, подготовленную для канюляции аорты, и потяните оставшуюся аорту через канюлю из тупой стали 20-го калибра.

Закрепите его на вырезе канюли красивым швом 5-0. Наложить шов на левую переднюю нисходящую артерию навсегда с помощью шва 6-0 в месте индукции реперфузного острого инфаркта миокарда. Введите 400 микролитров PBS, содержащего 20 микрограммов антитела NT CD31 мыши, меченного LexaFluor 546, ретроградно через вставленную канюлю.

Осторожно вытащите канюлю из аорты и перенесите сердце в 15-миллилитровую полипропиленовую реакционную трубку, содержащую 10 миллилитров 4%-ного параформальдегида. Инкубируйте пробирку на ночь при температуре четыре градуса Цельсия в темноте без перемешивания. Промойте зафиксированное сердце в трех сменах по пять миллилитров PBS в течение 10 минут каждая при комнатной температуре в темноте, используя вращение почти над головой для перемешивания внутри пятимиллилитровых полипропиленовых реакционных пробирок.

Обезвоживайте зафиксированное сердце в пяти миллилитрах 50% этанола в деионизированной воде в течение не менее двух часов при комнатной температуре в темноте, взбалтывая вращением почти над головой в пятимиллилитровых реакционных пробирках. Чтобы отбелить обезвоженное сердце, перенесите его в 15-миллилитровую реакционную пробирку, содержащую 10 миллилитров 100% этанола с 5% диметилсульфоксида и 5% перекиси водорода, и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в темноте в течение четырех часов без перемешивания. Отбеленное сердце промыть в пяти миллилитрах 100% этанола три раза по 12 часов каждый при комнатной температуре в темноте, используя вращение почти над головой для перемешивания в пятимиллилитровых реакционных пробирках.

Перенесите сердце в пятимиллилитровую реакционную трубку, содержащую четыре миллилитра этилциннамата, и инкубируйте его без перемешивания в течение трех суток при комнатной температуре в темноте. Отрежьте прозрачные гелевые и десневые блоки до размера, который стабилизирует очищенное сердце в держателе для образцов микроскопа. Для получения изображения используйте объектив с числовой апертурой 0,1 и рабочим расстоянием 17,6 миллиметра.

Затем определите сигналы флуоресценции с помощью соответствующих настроек фильтра возбуждения и излучения. Для визуализации методом световой листовой микроскопии выберите числовую апертуру листа 0,079, в результате чего толщина светового листа составит пять микрометров. Установите расстояние между двумя отдельными плоскостями Z равным 10 микрометрам.

Используйте ширину листа 100%, чтобы добиться равномерного освещения образца. На рисунке представлены репрезентативные срезы сердца, локализующие зону риска, эндотелиальное повреждение и инфильтрированные нейтрофилы с использованием многоканального окрашивания антителами и аутофлуоресценции. Зона риска была идентифицирована по отсутствию окрашивания CD31 после ретроградной инъекции, повреждению эндотелия внутривенным CD31-негативом и инфильтрации нейтрофилов Ly6G-положительными точками, преимущественно вблизи зон повреждения.

3D-рендеринг показал перекрытие между AAR, эндотелиальным повреждением и кластерами нейтрофилов, что позволяет предположить региональную иммунную локализацию. Количественное определение показало 90,2% нейтрофилов в AAR против 9,8% в отдаленных регионах, что указывает на локализованное воспаление. В пределах AAR 79,3% нейтрофилов находились вне объемов эндотелиального повреждения и 20,7% внутри, что свидетельствует о периферической кластеризации вокруг повреждения.