Выделение, бактериологическое исследование и характеристика фибробластов, ассоциированных с раком предстательной железы

Мы стремимся понять механизм, с помощью которого ассоциированные с раком фибробласты способствуют прогрессированию опухоли при раке предстательной железы, с целью нейтрализации этих перекрестных помех в качестве терапевтической стратегии. Различные популяции CAF с различными свойствами могут быть оценены в 3D-органоидах, полученных с использованием опухолевых и стромальных клеток при различных манипуляциях. Наш протокол позволяет надежно генерировать CAF для этих целей.

Основными проблемами являются надежная изоляция опухолевых и нормальных клеток из микроокружения одного и того же пациента, гетерогенность, отсутствие специфических маркеров CAF, пластичность CAF и ограниченные модели in vitro, повторяющие сложность TME. С помощью аналогичных методов мы охарактеризовали фундаментальную проопухолевую роль транскрипционного фактора STAT3 и его генов-мишеней в мышиных CAF рака молочной железы, продемонстрировав их эффективность в качестве терапевтических мишеней. Оптимально выделены фибробласты из опухоли и прилегающих нормальных участков образцов радикальной простатэктомии, полученных от пациентов с раком предстательной железы с использованием небольшого количества ткани.

Для начала взвесьте образцы тканей на весах в первый день для выделения фибробластов. С помощью стерильных щипцов переложите ткань в шестисантиметровую посуду. Промойте салфетку дважды в четырех миллилитрах ледяного PBS и дважды в четырех миллилитрах ледяного полного DMEM.

Теперь перенесите ткань в шестисантиметровую пластину на лед. Добавьте в тарелку один миллилитр антибиотика, дополненного ДМЭМ. Затем с помощью ножниц или лезвий измельчите ткань на фрагменты размером менее одного квадратного миллиметра.

Переложите измельченную салфетку в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую пять миллилитров ледяного полного DMEM. Затем центрифугировать суспензию при 754 g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. С помощью пипетки объемом 10 миллилитров удалите надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах ледяного льда, завершите DMEM и снова центрифугируете. После удаления надосадочной жидкости суспендировать гранулу в растворе коллагеназы II. Переложите суспензию в микропробирки объемом 1,5 миллилитров.

Заклейте микротрубки парафиновой пленкой. Затем поместите их при температуре 37 градусов Цельсия для ночного переваривания с непрерывным покачиванием в течение восьми-12 часов. На следующий день переложите переваренные образцы в конические пробирки объемом 15 миллилитров.

Пипеткой пять миллилитров ледяного полного DMEM для инактивации коллагеназы. Затем центрифугировать суспензию при 754 g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре 0,05% трипсина-ЭДТА после пипетирования надосадочной жидкости.

Выдерживать в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия с периодическим встряхиванием. Далее пипеткой нанесите на образцы один миллилитр свежеприготовленного раствора ДНКазы I и хорошо перемешайте. После центрифугирования и удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах холодного полного комплекта DMEM и снова центрифугируйте.

Ресуспендируйте полученные клетки в полную DMEM с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки. Поместите клетки в тарелки и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом и влажностью 95% в течение не менее трех дней. Через три дня исследуйте клетки на морфологию и жизнеспособность.

Как только клетки достигнут слияния, пропустите их в 10-сантиметровую чашку, содержащую полный DMEM с 20% фетальной бычьей сывороткой. Фибробласты, ассоциированные с раком пластин, или нормальные фибробласты с конфлюенцией 70% в 12-луночных планшетах. На следующий день добавьте 0,45 грамма агара с низкой температурой плавления к 12,5 миллилитровым PBS в коническую пробирку объемом 50 миллилитров в стерильных условиях.

Растворите смесь с помощью микроволновой печи. Охладите агаровый раствор до 37 градусов по Цельсию. Затем разведите в соотношении один к четырем с предварительно подогретым полным DMEM для приготовления рабочего раствора.

Отсасывайте среду из 12-луночной пластины. Пипеткой внесите по 500 микролитров рабочего раствора агара в каждую лунку. Инкубируйте в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы дать возможность затвердеть агару.

Тем временем держите оставшийся раствор агара при температуре 37 градусов по Цельсию. Трипсинизируйте опухолевые клетки и приготовьте клеточную суспензию из 20 000 клеток на миллилитр. Смешайте равные объемы суспензии опухолевых клеток и раствора агара для получения конечного объема в семь миллилитров, что составляет три технические репликации на каждое условие.

Проводите пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы обеспечить равномерное перемешивание. Затем дозируйте 500 микролитров этой смеси, содержащей примерно 5000 клеток, поверх затвердевшего базового слоя в каждой лунке. Дав агару застыть в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия, добавьте по одному миллилитру полного DMEM в каждую лунку.

Меняйте среду через день, осторожно отсасывая от края лунки и добавляя свежую среду в центр. Инкубируйте до тех пор, пока колонии не станут хорошо заметными. Как только колонии станут видны, выбросьте питательную среду.

Затем окрашивают колонии 200 микролитрами раствора нитросинего тетразолия хлорида. Инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном инкубаторе. На следующий день выбросьте раствор для окрашивания.

Получение изображений окрашенных колоний с помощью стереомикроскопа. Чистые фибробласты были успешно выделены. Во многих случаях, особенно на ранних стадиях, ассоциированные с раком фибробласты демонстрировали более веретенообразную морфологию по сравнению с нормальными фибробластами.

Количественный анализ подтвердил, что пролиферация клеток DU145, обработанных связанными с раком фибробластами, была значительно выше в течение 120 часов, чем у тех, которые лечились нормальными фибробластами или не лечились. Клетки DU145, культивируемые непосредственно с ассоциированными с раком фибробластами и нормальными фибробластами, также показали повышенную пролиферацию в течение 96 часов по сравнению с контрольной группой. Соответствующие кривые роста показали, что совместное культивирование с ассоциированными с раком и нормальными фибробластами привело к аналогичному увеличению пролиферации DU145 с течением времени.

Влияние кондиционированной среды на пролиферацию DU145 варьировало в зависимости от ассоциированных с раком фибробластов и нормальных пар фибробластов, при этом ранние пары пассажей демонстрировали значительно более сильные эффекты, чем более поздние. В анализах образования колоний мягкого агара как ассоциированные, так и нормальные фибробласты увеличивали количество и размер колоний DU145 по сравнению с контрольной группой, что указывает на усиленный рост, независимый от анкориджа. Отделившиеся слои фибробластов, образовавшиеся из-за технических проблем, препятствовали образованию колоний в некоторых репликах.

Кондиционированные среды сами по себе не способствовали образованию независимых от якоря колоний в клетках DU145.