Просвечивающая электронная микроскопия как метод визуализации для анализа циркадной синаптической пластичности в коре ствола головного мозга мыши

Нас интересует нейронная пластичность, в частности, циркадные изменения пластичности синапсов, нейронов и глиальных клеток. Мы пытаемся ответить на вопрос, как трансформируются синапсы в течение дня и ночи и при патологических состояниях. Самые последние разработки в нашей области исследований заключаются в использовании различных генетических инструментов для манипулирования экспрессией генов, в том числе с использованием методов визуализации изменений в мозге, а также в настоящее время растет число животных моделей для изучения нейродегенеративных заболеваний. С помощью электронно-просвечивающего микроскопа мы обнаружили, что количество синапсов в коре головного мозга мышей изменяется в течение дня и ночи. И этот ритм тоже циркадный, по крайней мере, в случае тормозных синапсов. Поскольку тормозные синапсы увеличиваются в течение ночи, в то время как возбуждающие синапсы увеличиваются в течение дня. Аналогичные изменения мы обнаружили и в мозге плодовой мушки. У этого вида количество синапсов также изменяется в течение дня и ночи. Кроме того, мы обнаружили структурные изменения в форме нейронов и глиальных клеток.

[Рассказчик] Для начала возьмите мозжечок мыши и разделите мозг на два полушария. Выберите одну полусферу и сориентируйте ее так, чтобы участки можно было разрезать по касательной к коре головного мозга. Затем разрежьте срезы толщиной 60 микрометров и перенесите их в раствор, содержащий 0,1-молярный фосфатный буфер и фиксатор в соотношении один к пяти. Рассмотрите срезы под световым микроскопом, и соберите только те срезы, на которых отчетливо видна кора бочкообразного поля. С помощью кисти аккуратно переложите срезы в небольшую стеклянную чашку Петри. Промойте участки мозга в 0,1-молярном какодилате. Затем зафиксируйте срезы в 1% тетраоксиде осмия в 0,1-молярном какодилатном буфере с 1,5% феррицианидом калия. После того, как срезы будут промыты в дистиллированной воде, с помощью шприца с 25-миллиметровым фильтром медленно дозируйте 70% этанола, содержащего 1% уранилацетата, в каждую чашку Петри с салфетками. После ночной инкубации в 70% этаноле при четырех градусах Цельсия промойте салфетки в 80%, 90% и 100% этаноле. Затем дважды промойте салфетки в пропиленоксиде по 10 минут каждая. Затем замените оксид пропилена двумя миллилитрами смеси Poly/Bed смолы и оксида пропилена в соотношении один к одному. Накрыть крышкой и выдерживать 40 минут. Поместите участки мозга в два миллилитра смеси Poly/Bed смолы и оксида пропилена в соотношении три к одному. Накрыть крышкой и оставить на 1,5 часа. Затем разрежьте пленку ACLAR на кусочки, соответствующие размеру стандартного предметного стекла. С помощью пластиковой пипетки нанесите небольшое количество смолы на каждый кусок пленки ACLAR. С помощью кисти перенесите участки мозга из чашки Петри на смолу на пленку ACLAR. Вставьте каждую секцию между двумя пленками ACLAR и инкубируйте для полимеризации. С помощью светового микроскопа с двукратным объективом сфотографируйте встроенные участки мозга. Чтобы открыть изображения, нажмите «Файл и открыть», выберите изображения, удерживая клавишу Shift, и нажмите «Открыть». Начните складывать изображения из коры головного мозга. Щелкните правой кнопкой мыши по Слою 1 на каждом изображении, выберите Дублировать слой и введите номер изображения в качестве имени в диалоговом окне. Выберите одно изображение в качестве конечного файла и нажмите OK. Затем используйте инструмент «Перемещение» для выравнивания изображений вручную и настройте ориентацию с помощью Редактирования, Трансформации, Поворота или Отражения по мере необходимости. Для более тонких корректировок используйте Редактировать, Трансформировать, Исказить и переместить углы по отдельности, чтобы они соответствовали анатомическим ориентирам. Установите режим наложения верхнего слоя на перекрытие на панели Слоёв для облегчения выравнивания. В каждом срезе, на котором отображается кора ствола, используйте стереомикроскоп для идентификации выбранного ствола, и вырежьте его вместе с соседним с помощью лезвия бритвы. После заделки секции в смоляной блок соберите ультратонкие секции на однощелевые никелевые сетки с покрытием Formvar. После выравнивания стека изображений ПЭМ, как было показано ранее, определите область анализа. Нажмите «Слой», затем «Новый» и «Слой», затем нажмите OK. Выберите инструмент «Прямоугольник», перейдите в «Слой», «Стиль слоя», «Обводка». Установите цвет, толщину и положение обводки на внутреннюю часть, затем нажмите OK. Теперь нарисуйте прямоугольник, чтобы определить границу анализа, и выберите Заполнить 0%. Чтобы добавить новый слой для аннотаций, выберите «Слой», «Новый», «Слой», затем нажмите OK. Используйте инструмент «Кисть», чтобы отметить синапсы на этом слое. Используйте инструменты «Масштаб» и «Рука» для обеспечения точности при аннотировании. Теперь откройте стек изображений, предназначенный для 3D-реконструкции. Выберите инструмент «Обрезка», отметьте область, содержащую дендритный шип, поперек стопки и нажмите клавишу Enter, чтобы обрезать эту область во всех видимых слоях. Чтобы сделать видимым только один слой за раз, переключите значок глаза на панели слоев. Нажмите «Файл», «Сохранить как», присвойте файлу имя, выберите формат JPG и нажмите «ОК», чтобы сохранить каждое обрезанное изображение отдельно. Откройте программу для 3D-реконструкции. Перед загрузкой нажмите Z на навигационном гизмо или нажмите цифровую клавиатуру 7, чтобы выровнять перспективу видового экрана. Затем, чтобы загрузить изображения, нажмите «Добавить», «Изображение», «Ссылка», затем выберите первое изображение и дважды щелкните для подтверждения. Чтобы расположить итоговое изображение TEM вдоль оси z, щелкните по изображению. На панели «Свойства объекта» на правой боковой панели введите соответствующее значение в поле «Местоположение Z». Чтобы равномерно распределить все изображения по оси Z, выберите все объекты изображения. Нажмите клавишу End, чтобы открыть панель End. Перейдите на вкладку «Редактирование» и нажмите «Распределить Z», чтобы автоматически распределить их в зависимости от толщины сечения. Чтобы вручную обвести форму дендритного шипа на каждом изображении TEM с помощью одной кривой на каждом изображении, нажмите кнопку Добавить, Кривая и Окружность. Чтобы переместить круг, удерживая g, перетащите мышь, а затем щелкните, чтобы подтвердить размещение. Удерживайте s для регулировки размера, затем нажмите для подтверждения. Затем масштабируйте объект так, чтобы он совпал с формой дендритного шипа. Теперь измените изогнутую форму, чтобы она соответствовала границе позвоночника. Выберите контрольную точку, нажмите g, переместите точку и щелкните для подтверждения. При необходимости используйте клавиши g или s для регулировки точек маркеров, уточняя направление и интенсивность кривой. Чтобы добавить больше деталей, удерживайте клавишу Shift и выберите две соседние контрольные точки. Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Разделить», чтобы вставить новую точку между ними. Как только кривая точно очертит позвоночник, перейдите на вкладку «Макет», щелкните правой кнопкой мыши объект круга Безье и выберите «Дублировать объект», не перемещая мышь. Чтобы соединить ребра соединяемого объекта и сформировать замкнутую сетку, перейдите на вкладку Моделирование. Нажмите 2 , чтобы переключиться в режим выбора края. Нажмите «Выбрать», «Все», щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Петли кромок моста», чтобы связать кольца кромок вместе. Чтобы заполнить пробел в верхней части объекта, отмените выделение всех объектов, щелкнув рядом с ним. Удерживайте Alt и кликните по одному краю верхнего выступа, чтобы выделить всю петлю. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Вытянуть края», перетащите вверх вдоль оси z. Теперь нажмите s, переместите мышь внутрь, чтобы сжать новую петлю, и щелкните для подтверждения. Выделив петлю, щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Новая грань из ребер». Чтобы сгладить окончательную структуру, перейдите на вкладку «Модификаторы» на правой боковой панели. Нажмите кнопку "Добавить модификатор", перейдите в раздел "Создать" и выберите "Поверхность разбивки". Установите уровни видового экрана и рендеринга равными единице для равномерного сглаживания. Чтобы назначить цвет отдельным структурам, выберите нужный объект. Откройте вкладку «Материал» на правой боковой панели, нажмите «Создать» и установите базовый цвет. Выберите объект света для настройки освещения сцены. Нажмите и удерживайте g, переместите мышь, чтобы изменить положение света, и щелкните, чтобы подтвердить его новое местоположение. Чтобы расположить камеру для рендеринга, сориентируйте видовой экран так, чтобы он был обращен к дендритному шипу так, как он должен выглядеть в окончательном выводе. Нажмите Control + Alt + цифровая клавиатура 0, чтобы привязать камеру к текущему виду. Отрегулируйте рамку камеры, выделив ее, удерживая g, и переместите ее, чтобы уточнить кадрирование. Соматосенсорная кора головного мозга мышей была идентифицирована даже в неокрашенных срезах мозга, и все поле ствола можно было реконструировать с помощью цифровых инструментов, несмотря на распределение отдельных бочек по нескольким участкам. Последовательные ультратонкие ПЭМ-изображения позволили надежно классифицировать синапсы на возбуждающие и тормозные типы на основе серийных визуальных данных. Трехмерная реконструкция дендритных шипиков по серийным срезам позволила визуализировать морфологию шипов, выявив различные формы, такие как тонкие, грибовидные, короткие и промежуточные. Формы позвоночника были количественно определены на основе измерений, включая длину позвоночника, длину шеи и диаметры позвоночника, головы и шеи.