Производство системы частиц вируса SARS-CoV-2 для исследования вирусных жизненных циклов in vitro

Мы представляем оптимизированный протокол in vitro для производства вирусоподобных частиц SARS-CoV-2, которые точно имитируют подлинный вирус. Такой подход позволяет исследовать механизмы вирусной инфекции, сборки и выхода вирусной инфекции без ограничений, связанных с лабораторией уровня биобезопасности 3.

Наши исследования направлены на понимание биологии вируса SARS-CoV-2 и поиск лекарств, в частности из китайской медицины против SARS-CoV-2. Все исследования живого вируса SARS-CoV-2 должны контролироваться в лаборатории третьего уровня биобезопасности. И это экспериментальное ограничение делает исследование SARS-CoV-2 возможным только в нескольких жизнях. Вирус SARS-CoV-2 как и практический метод исследования SARS-CoV-2 возможен без ограничения биобезопасности третьего уровня лаборатории, и этот список будет очень полезным методом.

[Инструктор] Для начала посейте около 3 миллионов клеток HEK-293T в тканевый планшет диаметром 10 сантиметров с полной средой DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина. Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение примерно 24 часов. Проверьте беглость клеток под микроскопом. Разведите 60 микролитров PEI из расчета один миллиграмм на миллилитр исходного раствора с бессывороточной средой до получения конечного объема 200 микролитров. Теперь возьмите 200 микролитров бессывороточной среды и добавьте в нее 6,7 микрограмма N-плазмиды, 10 микрограммов плазмиды Luc-T20, 0,016 микрограмма S-плазмиды и 3,3 микрограмма M-IRES-E-плазмиды. Осторожно добавьте разведенный раствор PEI в раствор, содержащий плазмидное покрытие для вирусной структуры белков и инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 10 минут. Это решение для трансфекции. Осторожно капните раствор для трансфекции на клетки HEK-293T и осторожно поверните планшет для культуры тканей, чтобы обеспечить тщательное перемешивание. Замените среду для культивирования клеток средой DMEM complete через шесть часов после заражения и инкубируйте трансфицированные клетки HEK-293T при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 48 часов. Соберите надосадочную жидкость инфицированных клеток HEK-293T, которая содержит вирусоподобные частицы SARS-CoV-2. Отфильтруйте собранную надосадочную жидкость через шприц-фильтр 0,45 микрометра для удаления клеточного мусора. Это среда SC2-VLP. Засейте 40 000 клеток HEK-293T со стабильной экспрессией ангиотензинпревращающего фермента 2, или ACE2, и TMPRSS2 в 96-луночный планшет, а затем добавьте 50 микролитров среды SC2-VLP. Инкубируйте 96-луночный планшет для культуры тканей при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 24 часов. После инкубации извлеките среду из каждой лунки 96-луночного планшета и промойте один раз 100 микролитрами PBS, предварительно подогретыми до 37 градусов Цельсия. Лизируйте клетки HEK-293T, засеянные ACE2, TMPRSS2 клетки 20 микролитрами буфера пассивного лизиса и осторожно покачивайте образец на орбитальном шейкере в течение 15 минут при комнатной температуре. Вращайте 96-луночный планшет при 4000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия с помощью охлаждаемой микропланшетной центрифуги, а затем немедленно перенесите планшет на ледяную баню. Возьмите 100 микролитров восстановленного буфера для анализа люциферазы в новую непрозрачную белую 96-луночную пластину и добавьте по 20 микролитров лизата в каждую лунку. Быстро перемешайте, пипетируя вверх и вниз два-три раза. Измерьте сигнал люминесценции с помощью планшетного ридера. Далее для оценки состава среды SC2-VLP добавьте 1,36 миллилитра раствора PEG 8000 на 10 миллилитров среды SC2-VLP. Поместите смесь на орбитальный шейкер и медленно перемешивайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Центрифугируйте раствор при температуре 4 градуса Цельсия и 2000 G в течение 30 минут. И соберите гранулу SC2-VLP для анализа вестерн-блоттинга. Равномерно посейте около 3 миллионов клеток HEK-293T в чашку для культуры со стеклянным дном диаметром 15 мм и дайте клеткам прилипнуть и расти до тех пор, пока они не достигнут примерно 70% конфлюенции. После пересечения клеток, как было показано ранее, с модифицированным количеством плазмид, осторожно дважды промойте чашку для культивирования одним миллилитром ледяного PBS. Добавьте один миллилитр 4% раствора альдегида параформа при комнатной температуре, и выдержите 15 минут. Промойте клетки дважды в течение пяти минут каждый одним миллилитром PBS при комнатной температуре и пропитайте клетки, добавив один миллилитр 0,25% Triton X-100 в течение 10 минут. Снова промойте клетки дважды по пять минут каждая одним миллилитром PBS комнатной температуры. Затем добавьте один миллилитр 5% бычьего сывороточного альбумина на один час, чтобы блокировать неспецифические взаимодействия антител. Добавьте примерно 200 микролитров первичного раствора антитела, чтобы покрыть стеклянное дно, и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Затем удалите первичный раствор антител и промойте клетки три раза по пять минут каждый одним миллилитром PBS комнатной температуры. Теперь добавьте флуоресцентно конъюгированный раствор вторичного антитела и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа. После трехкратного промывания клеток PBS окрашивайте ядра 2,5 микрограммами на миллилитр раствора Хёхста при комнатной температуре в течение пяти минут. Наконец, после промывки клеток PBS наблюдайте за окрашиванием S-белка или органелл, прежде чем получать изображения с помощью конфокального микроскопа. Этот рисунок иллюстрирует чувствительность продукции SC2-VLP к различным трансфекционным объемам плазмиды, кодирующей спайковый белок. Титр SC2-VLP был самым высоким при трансфекции 0,016 мкг S-плазмиды и значительно снижался при 0,16 и 1,6 мкг s-плазмиды. Мутация H1271 в E в шиповидном белке значительно снижала титр SC2-VLP по сравнению с диким типом. Мутация E1262 в H привела к умеренному снижению титра SC2-VLP, в то время как двойная мутация E1262 в H, H1271 в E полностью отменила продукцию. Полноразмерные полосы белков S и S-2 были уменьшены в линиях E1262-H и двойных мутантных линиях по сравнению с диким типом. Эффективность упаковки S также была снижена у мутантов E1262 к H и H1271 к E и почти отменена у двойных мутантов. Численность VLP оставалась в основном неизменной у дикого типа и у всех S-мутантов. Белок S-типа дикого типа колокализован с маркером цис-Гольджи GM130, но не с маркером ER Sec61 beta или маркером ERGIC ERGIC 53. Мутантный S-белок H1271 к E демонстрировал диффузное цитоплазматическое распределение и отсутствовал колокализацию с GM130.