Пошаговое руководство по выделению и анализу поверхности листа и апопластической РНК с использованием розеток Arabidopsis

Мы пытаемся понять, как растения регулируют свои микробиомы и регулируют ли выделяемые растениями РНК экспрессию генов как у прокариотических, так и у эукариотических микробов, колонизирующих растения. Мы используем комбинацию электрофореза оболочки с высоким разрешением и анализа на основе Illumina для оценки РНК, присутствующих на поверхности листа, и того, как они изменяются в ответ на биотический стресс. В то время как недавние исследования показывают, что внеклеточные РНК поглощаются грибковыми и бактериальными патогенами, основные механизмы поглощения РНК и функциональные последствия этого поглощения остаются в значительной степени неизученными.

Для начала возьмите шести-семинедельные растения арабидопсиса для каждой реплики. Добавьте силуэт Л-77 в стерильный ВИБ, перед началом изоляции поверхности листа промывка. Затем с помощью мерного цилиндра перелейте 100 миллилитров приготовленного раствора VIB в 500-миллилитровый пульверизатор.

С помощью тонких ножниц аккуратно отделите розетки арабидопсиса от их корней. После этого с помощью мягкой щетки удалите лишнюю почву с лепестков. Выложите отделенные розетки на плоский поднос абаксиальной поверхностью вверх.

Затем распылите на абаксиальную поверхность с помощью пяти насосов пульверизатора, наполненного VIB и смачивающим средством. Аккуратно переверните розетки и опрыскайте адаксиальную поверхность. Подготовьте модифицированные шприцы с отверстиями на дне, обернув их пара-пленкой вокруг горлышка, чтобы кончик был подвешен над дном флакона.

Чтобы восстановить поверхность листьев, осторожно вставьте распыленные розетки в безыгольные 60-миллилитровые модифицированные шприцы, помещенные в 250-миллилитровые центрифуговые бутылки, и распылите два твердых насоса буфера в шприц. Затем центрифугируйте загруженные бутылки при 100 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Теперь отфильтруйте восстановленную поверхность листа, промойте через шприц-фильтр 0,22 микрометра и соберите фильтрат в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, держите на льду.

При использовании метода тампона с поверхности листьев опрыскайте отделенные розетки раствором VIB и смачивающего агента таким же образом, как описано на предыдущем этапе. Чтобы восстановить тампон с поверхности листа, используйте стерильные ватные палочки для взятия мазка как с адаксиальной, так и с абаксиальной поверхности розеток. Затем прижмите смоченные кончики к внутренней стенке центрифужной пробирки объемом 15 миллилитров, чтобы извлечь жидкость.

Отфильтруйте взятый образец тампона с поверхности листа через шприц-фильтр 0,22 микрометра в двухмиллилитровую пробирку, помещенную на лед. Поместите тот же набор растений, который ранее использовался для промывки поверхности листьев или изоляции тампона, в чистую мензурку и аккуратно дважды промойте их дистиллированной водой. Чтобы вакуумировать розетки с помощью VIB, осторожно поместите промытые розетки во френч-пресс кофеварку, содержащую от 300 до 500 миллилитров VIB.

Закройте крышку и осторожно опустите поршень до полного погружения розеток. Вставьте френч-пресс в вакуумную камеру и подайте вакуум в течение 20 секунд с помощью вакуумного насоса, пока растения не будут хорошо инфильтрированы. Выпустив вакуум, извлеките френч-пресс из камеры и снимите крышку.

Налейте VIB в пластиковый стакан объемом 500 миллилитров и снимите розетки. Затем аккуратно встряхните розетки и смажьте листья бумажным полотенцем, чтобы удалить излишки буфера. Теперь с помощью промокательной бумаги аккуратно промокните поверхность листьев, чтобы удалить остатки буфера.

Чтобы собрать апластическую промывочную жидкость, вставьте инфильтрированные VIB розетки в 60-миллилитровые безыгольные шприцы, помещенные внутрь 250-миллилитровых бутылок центрифуги, как это делалось ранее. Центрифугируйте флаконы при 600 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия с медленным ускорением. Затем отфильтруйте скопившуюся пластиковую жидкость для промывки через шприц-фильтр 0,22 микрометра в 15-миллилитровой трубке, помещенной на лед.

Приготовьте или приобретите мини-гель, содержащий 10 или 15% полиакриламида и семь моляров мочевины в буфере ЭДТА трисборовой кислоты, используя раствор акриламида и биса. Затем смешайте образцы РНК с двукратным денатурирующим загрузочным буфером. Нагрейте смесь до 65 градусов Цельсия в течение пяти минут и сразу же положите ее на лед.

Теперь разрешите образцы РНК в 0,5-кратном TBE работающем буфере при комнатной температуре, подавая напряжение 220 вольт в течение примерно одного часа и 15 минут. Затем окрашиваем гель кибер-золотым порошком нуклеиновой кислоты в 0,5 раза TBE на 10 минут. Дважды промойте гель дистиллированной водой и визуализируйте его с помощью системы визуализации.

Чтобы количественно определить разрешенные полосы РНК, используйте метод анализа геля из документации Image J в меню анализа и анализа геля. Подготовка стандартов РНК для двух технических репликатов путем разбавления РНК лизата клеток в воде, свободной от РНКазы и ДНКазы. Чтобы приготовить в 1,5 раза гелевое окрашивание нуклеиновой кислоты кибер-золота, растворите его в 500 миллимолярном трис HCL буфере при pH 8.

Для установки микропланшета добавьте в каждую лунку по 99 микролитров дистиллированной воды. Затем добавьте по одному микролитру РНК в каждую лунку, используя один и тот же объем как для образцов РНК, так и для стандартов. Наконец, добавьте в каждую лунку по 50 микролитров раствора киберзолота.

Чтобы задать параметры считывателя микропланшетов, выберите линейное или орбитальное встряхивание в течение трех секунд. Установите считыватель микропланшетов в режим конечной точки флуоресценции с длиной волны возбуждения 496 нм и длиной волны излучения 540 нм. Постройте калибровочную линию, используя значения интенсивности флуоресценции из стандартов РНК.

Анализ геля денатурирующей РНК показал, что образцы как промывочной поверхности листа, так и образцы апластической промывочной жидкости содержат широкий диапазон размеров РНК, включая как длинные, так и малые виды РНК. Общее количество РНК, выделенное из апластической промывочной жидкости и смывателя поверхности листьев, было одинаковым при нормализации до свежего веса растения. РНК-профили промывки листовой поверхности, апластической промывки и клеточного лизата заметно различаются, что подтверждает минимальное внутриклеточное загрязнение РНК и показывает, что добавление 0,001% силуэта L-77 в изоляционный буфер везикул почти удвоило выход РНК с поверхности листьев по сравнению с буфером без смачивающего агента.

Но увеличение этой концентрации до 0,01% не способствовало дальнейшему восстановлению РНК. Вторая промывка тех же листьев восстановила примерно 63% РНК, полученной при первой промывке, что указывает на продолжающуюся секрецию РНК на поверхности листа. Количественное определение РНК с использованием флуоресцентных микротитровых пластин продемонстрировало высокую линейность концентрации РНК как для кибер-золота, так и для методов детектирования RIBO 488.

Мы показали, что тРНК и производные фрагменты тРНК, или TDR, особенно распространены во внеклеточной РНК, вероятно, из-за их устойчивости к деградации. Таким образом, мы считаем, что эти TDR, вероятно, регулируют экспрессию генов у бактерий. Мы хотим определить клеточные источники РНК поверхности листа и биологическую роль, которую эта РНКаза поверхности листа может играть в контексте запланированных взаимодействий микробов.