Живое изображение и характеристика динамики микроглии и взаимодействия с синапсами в заболевшей сетчатке мыши

Область исследований нашей лаборатории заключается в изучении основных механизмов глаукомы и микроглии в ремоделировании синапсов в процессе развития. Текущие экспериментальные задачи связаны с тем, активно ли микроглия разрушают синапсы ганглиозных клеток сетчатки или они просто пассивно очищают мусор. Начните с сетчатки мыши на фильтрующей бумаге и высушите её лабораторной салфеткой.

Инвертируйте сетчатку на чашку MatTek Petri. Утяжелите сетчатку с помощью металлических бусинок или кольца. Затем добавьте от трёх до пяти капель искусственной спинномозговой жидкости.

Поместите образец под вращающийся дисковый конфокальный микроскоп и отрегулируйте настройки для предварительного просмотра сетчатки. Собирайте изображения вдоль оси Z на общей глубине от 10 до 20 микрометров, используя шаг размером 0,3 микрометра. Поддерживайте интервал между кадрами в 20–30 секундах для надёжного отслеживания ячеек.

Для выполнения поверхностного рендеринга микроглии преобразуйте таймлапс-файл в формат IMS с помощью программного обеспечения для конвертации файлов. Введите размеры вокселей на основе ранее полученных свойств изображения. В программном обеспечении анализа нажмите на папку наблюдения, чтобы открыть конвертированный файл и убедиться, что изображение находится в 3D-виде.

Чтобы обнаружить отдельные микроглии, нажмите на значок «добавить новую поверхность» на панели инструментов объектов. Выберите сегментацию только интересующую область, отслеживайте поверхности во времени, классифицируйте поверхности и статистику объект-объект в настройках алгоритма. Затем нажмите синюю кнопку воспроизведения, чтобы продолжить.

Выберите канал для рендеринга поверхности. Опционально включите smooth для сглаживания создания поверхности и входа в детализацию поверхности. В разделе порогового значения выберите сегментацию машинного обучения для обнаружения ячеек.

Под обучаемыми данными используйте инструменты для кистей на фоне и переднем плане. Рисуйте мазки кистью, выбрав нужную кисть и используя Shift плюс левый клик. Убедитесь, что интерполяция отображения включена, затем выберите «Обучать и предсказать».

Используйте жёлтый указатель посередине, чтобы перемещаться по оси Z. Нарисуйте несколько штрихов по плоскостям X, Y и Z, а также в нескольких временных промежутках. Используйте от трёх до пяти коротких штрихов на каждую запись, постепенно корректируя до получения точной поверхности.

Используйте жёлтый прямоугольник, чтобы переключаться между тренировочным дисплеем и реальной поверхностью, созданной в качестве финальной проверки. Также проверьте, что поверхность соответствует морфологии клетки через таймлапс. После этого снимите выделение разделённых объектов.

Отрегулировать порог воксельной гистограммы, чтобы удалить небольшие несвязанные объекты, не входящие в основную поверхность. Затем вручную отредактируйте поверхность, чтобы удалить лишние предметы или обрезать края с помощью ножницы. Если желаете, установите порог допустимых промежутков для объекта и выберите алгоритм отслеживания движущейся ячейки.

Фильтруйте объекты отслеживания, не связанные с основной поверхностью. После завершения установите дисплей движущихся ячеек на прозрачный профиль, чтобы визуализировать пункт для следующих шагов. Чтобы определить отдельные пункты PSD95, нажмите на синюю иконку поверхности на панели инструментов объектов.

Затем выбирайте точки для отслеживания со временем, классифицируйте их и статистику объект-объект и нажмите воспроизведение. Выберите исходный канал для синаптического маркера. Отключите слайсер и другие каналы, чтобы визуализировать только PSD95.

Используйте кнопку управления и инструмент выбора указателя, чтобы оценить XY диаметр пункты. Выберите несколько ярких пунктов, которые сохраняются по кадрам, и отключите фоновый вычитание. Далее добавьте фильтр по качеству пятна.

Скорректируйте гистограмму, чтобы она включала точную пункту PSD95 во всех временных промежутках. Удалите ложноположительные пятна с помощью редактирования. Переключайтесь между кубом или круговым курсором, чтобы удалить пятна, длящиеся всего один или два кадра.

При желании установить порог допустимых промежутков и выбрать алгоритм отслеживания синаптических пятен. Фильтрующие точечные дорожки, не связанные с реальными пунктами, используют порог гистограммы для исключения дорожек мелких объектов. Определите классификации, используя наименьшее расстояние до классификации поверхности.

Установлен в виде любого пункта меньше нуля микрометров, контакт находится примерно на расстоянии от нуля до 0,5 микрометров от поверхности, а не контакт — более 0,5 микрометров. Присваивайте метки событиям, используя вышеуказанные классификации. Когда поверхности и пятна правильно отражают микроглию и пункту, экспортируйте всю статистику во вкладку статистики.

Микроглия показала увеличенную длину смещения отростка после лазерно-индуцированной глазной гипертензии по сравнению с контрольной группой. Микроглиальная скорость была значительно выше у глаз, обработанных лазером, чем у контрольных. Количество контактных событий между микроглией и PSD95 пункта увеличилось после лазерного лечения.

Таймлапс-записи показали, что обработанные лазером сетчатки демонстрировали большую микроглиальную подвижность и усиление взаимодействия с PSD95 пункта по сравнению с контрольными сетчатками. Наши значимые результаты показали, что у мышей наблюдается увеличение числа, сложность и подвижность микроглий, а также синаптическая колокализация. Наш протокол предлагает ex vivo визуализацию, которая помогает избежать проблем с катарактой и непрозрачностью роговицы, что облегчает установку для более быстрых экспериментов и обеспечивает большую пропускную способность.

Наши результаты способствуют исследованиям, позволяя визуализировать взаимодействия микроглии и нейронов, клеточную коммуникацию и динамику с помощью трансгенных флуоресцентных линий, а также высококачественную таймлапс-визуализацию.