Измерение циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) в твердых тканях с помощью конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА)

Лаборатория Дехтера исследует метаболизм оксида азота. Оксид азота стимулирует циклическое образование ГМФ через адаптивный гомеостазный каскад. Мы стремимся узнать, как старение, диета и другие факторы влияют на этот каскад. Предыдущие исследования были сосредоточены на образовании оксида азота и вытекающих из этого физиологических эффектах пренебрежения каскадом, соединяющим их. Наш протокол измеряет циклический GMP, второй мессенджер в каскаде. Наш протокол прост, доступен и легко адаптируется к различным типам тканей.

[Рассказчик] Для начала,

Поместите тканевый измельчитель, пинцет и ложку на сухой лед на 10 минут. Взвесьте избыток свиной ткани, чтобы учесть потери во время измельчения. Переложите салфетку в охлажденный пульверизатор, помещенный на сухой лед. Мгновенно заморозьте ткань, залив жидкий азот в измельчитель, и дайте ему полностью испариться, прежде чем продолжить. Затем установите на место крышку пульверизатора и ударьте по ней 15 раз с помощью молотка. Теперь поставьте трубку гомогенизатора на весы. С помощью охлажденной ложки и пинцета перенесите измельченную ткань в трубку. Пипеткой введите 0,1 обычной соляной кислоты в гомогенизационную трубку, следя за тем, чтобы объем в микролитрах был кратно массе ткани в миллиграммах. Затем гомогенизируйте образец ткани с помощью гомогенизатора бисерной мельницы. Центрифугируйте гомогенат при 17 000 г в течение 30 минут, поддерживая температуру образца на уровне четырех градусов Цельсия. Переложите полученную надосадочную жидкость в микроцентрифужную пробирку. Снова центрифугируйте в течение 10 минут, поддерживая температуру образца на уровне четырех градусов Цельсия. Пипеткой нанесите аликвоту конечного надосадочной жидкости в микроцентрифужную пробирку и поместите ее на лед. Далее пипеткой внесите 9,9 миллилитров буфера ИФА в пробирку с маркировкой Стандарт В. Пипетку нанесите 100 микролитров стандартного стокового раствора в стандартную В-пробирку. Тщательно оборвать, чтобы обеспечить равномерную подвеску. Перелейте 1 000 микролитров раствора из стандарта B в пробирку с маркировкой Standard 1. Затем добавьте 500 микролитров буфера ELISA в пробирки с маркировкой Стандарт 0 и Стандарты со 2 по 8. Вихревой Стандарт 1. Затем перелейте 500 микролитров раствора в Стандарт 2. Затем вихревой Стандарт 2, и переложите 500 микролитров раствора в Стандарт 3. Продолжайте перекладывать 500 микролитров из каждого предыдущего стандарта в следующий, тщательно перемешивая после каждого издания, пока не будет подготовлен стандарт 8. Для ацетилирования образцов добавьте 50 микролитров гидроксида калия четырех моляров в аликвоту образца объемом 250 микролитров. Сразу добавьте 12,5 микролитров ангидрида уксусной кислоты. Вортексируйте раствор в течение 15 секунд. Затем пипетку 12,5 микролитров четырех моляров гидроксида калия и снова вортекс. В пробирку с маркировкой Стандарт 0 добавьте 100 микролитров четырех моляров гидроксида калия, а затем сразу 25 микролитров уксусного ангидрида. После вортекса пипеткой внесите 25 микролитров гидроксида калия четырех моляров в пробирку и кратковременно сделайте вихрь. Повторите добавление гидроксида калия и ангидрида уксусной кислоты с последующим вортексированием для остальных стандартов, добавьте заданное соотношение буфера ИФА и аликвоты ацетилированного образца в микроцентрифужную пробирку. Вихревой Стандарт 0. Переложите 50 микролитров аликвот стандарта 0 в пять лунок, обозначенных как нулевые лунки NSB и B микропланшета ELISA. Затем добавьте 50 микролитров буфера ИФА в две лунки NSB, содержащие стандарт 0. С помощью одного наконечника для дозатора добавьте 50 микролитров аликвот стандартов с 1 по 8 в дублирующие лунки, начиная со стандарта 8 и переходя к стандарту 1. Закрутите каждый образец. Затем добавьте 50 микролитров в соответствующие лунки в двух или трех экземплярах. Теперь пипетируйте 50 микролитров индикатора ацетилхолинэстеразы во все лунки, обозначенные как NSB, B nought, стандартные и пробные. Добавьте по 50 микролитров антисыворотки в каждую ячейку В, стандартную и лунку. Накройте планшет с методом ИФА и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 18 часов. После инкубации переверните планшет ИФА над контейнером для отходов, чтобы утилизировать содержимое. Заполните лунки промывочным буфером с помощью промывочной бутылки. Аккуратно помешивайте в течение пяти секунд. Затем слейте буфер для стирки и выложите оставшуюся жидкость на бумажное полотенце. Теперь перенесите реагент Эллмана в резервуар. Работая быстро, используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 200 микролитров реагента Эллмана в пустые, NSB, B nought, TA, стандартные лунки и лунки для проб. Добавьте пять микролитров индикатора ацетилхолинэстеразы в лунку ТА. Затем накройте пластину ИФА парапленкой. Поместите его в легкую защищенную емкость для инкубации при комнатной температуре с перемешиванием в течение от 60 до 90 минут. Снимите парапленку и считайте оптическую плотность при 412 нм Циклическая концентрация GMP в печени свиньи в контрольной группе составила примерно 0,0202 наномоли на грамм ткани. В группе, получавшей нитраты, циклическая концентрация GMP увеличилась примерно до 0,0364 наномолей на грамм ткани.