Разработка инновационного устройства светодиодного освещения для применения in vitro фотодинамической терапии с розовой бенгалией

Предметом наших исследований является разработка фундаментальных и трансляционных проектов, направленных на характеристику эффекта фотодинамической терапии в лечении онкологических заболеваний, не имеющих эффективных терапевтических возможностей. В настоящее время экспериментальными задачами являются разработка технологий, необходимых для реализации фотодинамической терапии от in vitro до клинического применения, включая новые фотосенсибилизаторы и новые устройства освещения. По сравнению с другими методами, наш протокол включает в себя недорогое и самодельное устройство, обеспечивающее более щедрое освещение 96-луночного планшета и физиологическое состояние внутри инкубатора для клеточных культур.

Для начала извлеките культивируемые клетки HepG2 из инкубатора и поместите колбу под предварительно очищенную станцию микробиологической безопасности. С помощью пипетки извлеките питательную среду из колбы с культурами. Чтобы удалить остаточную среду, промойте фосфатным буферным раствором при осторожном перемешивании, затем осторожно удалите буфер.

Затем нанесите на клетки три миллилитра раствора трипсина, содержащего 0,25% трипсина и 0,53 миллимоляра ЭДТА, и поместите культуру обратно в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на пять минут, чтобы отделить клетки. Через пять минут добавьте в колбу семь миллилитров питательной среды для нейтрализации трипсина и приостановки клеток. Теперь перенесите трипсин, среду и отдельные клетки в 15-миллилитровую центрифужную пробирку.

Чтобы подсчитать клетки, пипеткой наберите 20 микролитров клеточного раствора в чистую пробирку, и добавьте 20 микролитров раствора трипанового синего цвета. После смешивания загрузите окрашенную смесь на предметное стекло и вставьте ее в счетчик ячеек. Затем добавьте питательную среду в пробирку, затем введите клетки до достижения конечной концентрации 150 000 клеток на миллилитр.

Засейте в 1,5 раза по 10 в степени четырех ячеек на лунку в белую 96-луночную пластину с прозрачным плоским дном. Подготовьте две пластины для каждого времени чтения жизнеспособности. Инкубируйте планшеты в течение 24 часов до лечения, чтобы дать клеткам прикрепиться.

Чтобы приготовить стоковый раствор бенгальской розы, растворите его в 10%-ном солевом растворе. Растворы для обработки розовой бенгалии разбавляют в концентрациях от нуля до 100 микромоль в среде для культивирования клеток. Теперь удалите питательную среду из клеточных планшетов и добавьте в каждую лунку по 100 микролитров приготовленных растворов для обработки розовой бенгалии.

Инкубируйте клетки с розовой бенгальской розой в течение двух часов, чтобы обеспечить интернализацию. Через два часа удалите раствор розовой бенгалии из каждой лунки, дважды промойте клетки PBS, аспирируйте PBS и добавьте 100 микролитров на лунку свободной питательной среды для розовой бенгалии. Накройте микропланшеты алюминиевой фольгой, чтобы защитить их от света, и отложите половину пластин для освещения во время фотодинамической терапии.

Подсоедините штекерный разъем на распределителе света к гнездовому разъему источника света. Извлеките из инкубатора микропланшеты для фотодинамической терапии и темного состояния. Разверните пластину для фотодинамической терапии.

Затем установите диммер на светодиодном драйвере на максимальный уровень, чтобы обеспечить среднюю мощность излучения 0,62 милливатт на квадратный сантиметр в 96 лунках. После этого поместите пластину на светораспределитель. Подсвечивайте микропланшет до тех пор, пока не будет достигнута желаемая доза света на клетки.

Как только желаемая доза света будет достигнута, выключите устройство. Оберните микропланшет для фотодинамической терапии в алюминиевую фольгу и верните его вместе с контрольной пластиной в инкубатор до проведения теста на жизнеспособность. После завершения анализа фотодинамической терапии поместите освещенный планшет в инкубатор на 24 часа, чтобы обеспечить клеточный ответ после лечения.

По истечении инкубационного периода извлеките одну подсвеченную и одну неосвещенную пластины. Добавьте 100 микролитров реагента из набора для анализа жизнеспособности клеток в каждую лунку, чтобы измерить метаболизм митохондрий и выработку АТФ. Инкубируйте планшеты в темноте в течение 10 минут, прежде чем приступить к измерению люминесценции.

Через 10 минут считайте люминесценцию в каждой лунке с помощью мультимодального ридера. Рассматривайте люминесценцию из необработанных контрольных лунок как представляющую 100% жизнеспособность. Нормализуйте значения люминесценции из обработанных лунок в этот контроль, чтобы рассчитать процент жизнеспособности для каждого условия обработки.

Повторите тот же протокол для измерения жизнеспособности клеток в дополнительные моменты времени после лечения, такие как 24 часа, 48 часов и 72 часа. Только освещение без розовой бенгальской розы не изменяло жизнеспособность клеток HepG2 ни при одной из испытуемых доз света, и розовая бенгалия сама по себе без света также не вызывала существенных изменений во всех концентрациях. Фотодинамическая терапия, опосредованная розовой бенгалией с использованием CELL-LED-550/3, значительно снижала жизнеспособность клеток HepG2 при всех световых дозах, проявляя сильный цитотоксический эффект.

Перекрытие профиля излучения светодиодов и спектра поглощения розовой бенгалии подтвердило спектральную совместимость прибора CELL-LED-550/3 с фотосенсибилизатором. В будущем одной из наших основных целей является разработка новых пакетов ФДТ, каждый из которых будет содержать как светочувствительное соединение, обеспечивающее нацеливание на конкретные раковые клетки, так и связанное с ним осветительное устройство.