Ookluc: линия Plasmodium berghei для идентификации соединений, блокирующих трансмиссию

Наше исследование направлено на выявление и характеристику соединений, блокирующих передачу, и основных генов на половых стадиях Plasmodium с использованием высокопроизводительной системы для поддержки новых стратегий прерывания передачи малярии. Этот протокол устраняет отсутствие стандартизированных, высокопроизводительных методов идентификации соединений, блокирующих трансмиссию, с использованием трансгенной линии P.berghei с автоматическим детектированием развития паразитов после оплодотворения на фазе люминесценции. Этот протокол позволяет проводить скрининг половых стадий Plasmodium, обнаруживать соединения, блокирующие раннюю передачу, и поддерживает точное определение IC50, что дает преимущества по сравнению с традиционными методами.

Для начала подготовьте образцы состава, разбавив массу до одного миллимоляра с использованием окинетической среды. Подготовьте рабочие образцы, разбавив этот одномиллимолярный материал в среде оокинете в соотношении один к 100 для достижения конечной концентрации 10 микромоляров. Для одного анализа готовят итоговый объем в 200 микролитров рабочей пробы в двух экземплярах.

Если соединение растворено в растворителе, отличном от воды, готовят контрольный образец путем разведения растворителя в среде оокинета в той же пропорции, которая используется для испытуемого образца. Используя два 96-луночных планшета, поместите 80 микролитров каждого образца в специальные лунки для положительного контроля, отрицательного контроля, контроля растворителя и тестовых образцов в двух экземплярах, следуя заданной схеме. Добавьте четыре микролитра паразитированной мышиной крови в каждую лунку в соотношении один к 20, за исключением отрицательных контрольных лунок.

Аккуратно гомогенизируйте пипеткой вверх и вниз. Для отрицательного контроля добавьте неинфицированную кровь мыши в каждую лунку в соотношении один к 20 и аккуратно гомогенизируйте с помощью пипетирования. Поместите планшеты в инкубатор, установленный при температуре 21 градус Цельсия, и инкубируйте в течение шести или 24 часов.

После инкубации гомогенизируйте каждый образец путем пипетирования вверх и вниз, чтобы обеспечить правильное смешивание питательных сред крови. Непосредственно перед использованием приготовьте буфер для лизиса и смесь субстрата люциферазы в соотношении один к 50. Смешайте эту смесь субстрата для лизисного буфера с каждым образцом в соотношении один к одному, обеспечивая бережное перемешивание без образования пузырьков.

Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-пяти минут. Теперь перенесите образцы на 96-луночный белый планшет с плоским дном и измерьте люминесценцию с помощью планшетного ридера. После анализа люминесценции запишите исходные данные люминесценции, отображаемые считывателем пластин.

Используя электронную таблицу, рассчитайте среднее значение каждого измерения по заданной формуле. Замените XX адресом первой измерительной ячейки, а YY — адресом второй измерительной ячейки. Повторите формулу для всех образцов.

Преобразуем данные в процентное торможение по приведенной формуле, где A — выборочное значение относительной световой единицы, а B — контрольное относительное значение световой единицы. Выберите соединения, которые демонстрируют ингибирование более чем на 95%, для определения ингибирующей концентрации 50%. После заражения мышей Ookluc и сбора паразитированной крови готовят образцы соединений с использованием среды Ookinete в качестве разбавителя в начальной концентрации, которая показала 100% ингибирование конверсии.

Пипетируйте образцы в трех экземплярах в 96-луночный планшет в соответствии с указанной схемой. С помощью пипетки выполните двойное последовательное разведение, переливая 80 микролитров из лунки D1 в D2, тщательно перемешивая, затем перенося 80 микролитров из D2 в D3 и продолжая этот процесс до D12. Выбросьте последние 80 микролитров, удаленные из D12, чтобы сохранить 80 микролитров на лунку.

Теперь добавьте паразитированную мышиную кровь в каждую лунку в соотношении один к 20 и аккуратно гомогенизируйте с помощью пипетирования. В лунки с отрицательным контролем добавьте неинфицированную кровь мыши в соотношении один к 20 и аккуратно гомогенизируйте. Поместите планшет в инкубатор с температурой 21 градус Цельсия и инкубируйте в течение шести или 24 часов перед проведением анализа люминесценции.

После расчета процентного торможения откройте программное обеспечение для анализа и создайте таблицу XY для построения графика. Установите ось Y для ввода трех повторяющихся значений в параллельных подстолбцах. Вставьте данные в таблицу, где x представляет концентрацию соединения, а y — процентное ингибирование.

Теперь нажмите «Анализировать». Выберите «Нелинейная регрессия», «Аппроксимация кривой», затем выберите «Кривые «Доза-реакция», «Ингибирование», затем «Ингибитор против нормализованной реакции», «Переменный наклон» и нажмите «ОК». Просмотрите кривую «доза-реакция» на левой панели и примените настройки, такие как изменение цвета или формата точек.

Найдите таблицу нелинейной аппроксимации, чтобы найти вычисленный IC50 и 95% доверительный интервал. Пиримидин азепин 90 продемонстрировал явное зависимое от концентрации ингибирование целевой активности с более чем 95% ингибированием, наблюдаемым при концентрациях от 0,125 до одного микромоля, и полную потерю активности ниже 0,007 микромоляра, что свидетельствует о резком пороговом эффекте в его ингибирующем ответе. Кривая «доза-реакция», подобранная к данным пиримидина азепина 90, показала значение IC50 0,013 микромоляра, что указывает на высокую активность в ингибировании целевой активности.